LncRNA HOTTIP在胃癌D2根治術后腫瘤復發、耐藥及預后中的作用

沈珠花 徐永燦 喬鵬

[摘要] 目的 分析LncRNA HOTTIP在 胃癌D2根治術后腫瘤復發、耐藥及預后中的作用。 方法 隨機選取2018年1月至2020年6月在湖州市中心醫院行胃癌D2根治術的126例胃癌患者作為研究對象。 結果 胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達水平明顯升高，胃癌組織LncRNA HOTTIP表達水平與TNM分期、淋巴結轉移、侵襲深度及術后復發明顯相關。TNM分期、侵襲深度越高并伴有淋巴結轉移及術后復發的患者LncRNA HOTTIP越高。Kaplan-Meier生存曲線分析，LncRNA HOTTIP高表達組患者生存期均明顯低于LncRNA HOTTIP低表達組患者。SGC7901/DDP組細胞LncRNA HOTTIP表達水平明顯高于SGC7901組（P<0.01）。LncRNA HOTTIP低表達組細胞增殖能力及凋亡能力明顯強于對照組，存活率明顯低于對照組（P<0.05）。 結論 LncRNA HOTTIP在胃癌組織中的表達水平明顯升高，且其表達水平與患者的復發及預后明顯相關;經實驗發現，下調LncRNA HOTTIP的表達能夠明顯抑制細胞增殖，抑制細胞活性，促進細胞凋亡，降低胃癌細胞的耐藥性，提高對化療藥物的敏感性。

[關鍵詞] LncRNA HOTTIP;胃癌D2根治術;腫瘤復發;耐藥;預后

[中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）13-0042-05

[Abstract] Objective To analyze the role of LncRNA HOTTIP in tumor relapse， drug resistance and prognosis after D2 radical surgery for gastric cancer. Methods A total of 126 patients with gastric cancer who underwent D2 radical surgery for gastric cancer in Huzhou Central Hospital from January 2018 to June 2020 were randomly selected as study subjects. Results The expression level of LncRNA HOTTIP was significantly increased in gastric cancer tissues，which was significantly correlated with tumor node metastasis （TNM） stage，lymph node metastasis，invasion depth and postoperative relapse.The higher the TNM stage and the deeper the invasion depth， the higher the LncRNA HOTTIP expression level in patients with lymph node metastasis and postoperative relapse.The Kaplan-Meier survival analysis showed that the survival period was shorter in patients with high-expression level of LncRNA HOTTIP than that in patients with low-expression level of LncRNA HOTTIP.The expression level of LncRNA HOTTIP in the SGC7901/DDP group was significantly higher than that in the SGC7901 group（P<0.01）.The cell proliferation ability and apoptosis ability in the group with low-expression level of LncRNA HOTTIP were significantly higher than those in the control group， and the survival rate was significantly lower than that in the control group（P<0.05）. Conclusion The expression level of LncRNA HOTTIP is significantly increased in gastric cancer tissues， and its expression level is significantly correlated with the tumor relapse and prognosis of patients. Meanwhile， it is found that the down-regulation of LncRNA HOTTIP expression can significantly inhibit cell proliferation，suppress cell activity，promote apoptosis， reduce drug resistance of gastric cancer cells，and improve the sensitivity to chemotherapeutic drugs.

[Key words] LncRNA HOTTIP; D2 radical surgery for gastric cancer; Tumor relapse; Drug resistance; Prognosis

目前，臨床上治療胃癌主要采用手術聯合放化療的綜合治療方法，其中，順鉑是臨床上常用的化療藥物[1]。但化療藥物耐藥性的產生仍是造成術后患者復發的重要原因[2-3]。研究發現[4-5]，腫瘤細胞耐藥性的發生與機體內異常表達的長鏈非編碼RNA（long non coding RNA，LncRNA）關系密切。Wu等[6]研究發現，在卵巢癌中高表達的HOXA末端轉錄本反義RNA（HOXA transcript at the distal tip，HOTTIP）被認為是促進卵巢癌發生、發展及復發的重要因素。本研究旨在探討LncRNA HOTTIP對胃癌D2根治術后腫瘤復發、耐藥及預后的作用，為臨床治療提供相關依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2018年1月至2020年6月在湖州市中心醫院行胃癌D2根治術的126例胃癌患者作為研究對象。收集手術切除的胃癌組織及癌旁正常組織（各126例樣本）。納入標準：①所有患者均符合胃癌的診斷及治療標準[7]，且經病理學檢查確診;②無精神疾病史，能夠配合;③參與研究前未經放化療治療;④經醫院醫學倫理委員會批準;⑤患者及家屬均知情并簽訂知情同意書。排除標準：①病歷資料不全或中途退出者;②伴有乙肝等感染性疾病患者;③合并其他惡性腫瘤者。

人胃癌細胞系SGC7901（武漢普諾賽生命科技有限公司）。根據LncRNA HOTTIP對胃癌復發診斷的最佳截斷值分為LncRNA HOTTIP高表達組（n=67）與LncRNA HOTTIP低表達組（n=59）。

1.2 主要儀器及試劑

WB-1-15電熱恒溫水浴箱（上海實貝儀器設備廠）;WMJ-9590光學顯微鏡（上海豫光儀器有限公司）;TL-988-IV實時定量熒光PCR儀（濟南光耀醫療設備有限公司）;SIGMA 3-18K低溫高速離心機（華威科創（武漢）科技有限公司）;DW-86W300超低溫冰箱（浙江捷盛低溫設備有限公司）;逆轉錄試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司）;CytoFLEX流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）;胎牛血清（上海恒遠生物科技有限公司）;PBS緩沖液（重慶賽諾生物藥業股份有限公司）;兔抗人LC3單克隆抗體（上海易匯生物科技有限公司）;兔抗人Beclin1多克隆抗體（上?，庬嵣锟萍加邢薰荆?順鉑（齊魯制藥有限公司，國藥準字H37191358，規格：10 mg/瓶）。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR法檢測胃癌組織及癌旁正常組織中LncRNA HOTTIP表達情況? 取胃癌組織及癌旁正常組織進行實驗，使用核酸蛋白微量測定儀測定提取物RNA水平;使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，多次實驗以減小誤差。待反應完成后確認實時PCR擴增曲線與融解曲線，進行PCR定量時制作標準曲線，采用2-△△Ct的方法[其中ΔΔCt=（Ct，目的基因-Ct，管家基因）實驗組-（Ct，目的基因-Ct，管家基因）對照組]計算LncRNA HOTTIP的表達水平。引物序列見表1。

1.3.2 細胞培養? 構建SGC7901（SGC7901組）順鉑耐藥細胞株SGC7901/DDP（SGC7901/DDP組），培養出能夠耐受60 Um/L順鉑的胃癌耐藥細胞株SGC7901/DDP，取生長狀態良好的SGC7901/DDP細胞，加入胰蛋白酶消化，進行傳代培養，取生長狀態良好且處于對數生長期的細胞，繼續培養。

1.3.3 細胞轉染? 將生長狀態良好且處于對數生長期的細胞以10 000個/孔接種至96孔板，在細胞培養箱中培養至細胞密度達75%左右。將LncRNA HOTTIP干擾質粒及空白質粒轉染進SGC7901/DDP細胞內進行培養，取對數生長期細胞，以適當密度接種至6孔板，置于培養箱中進行培養，獲得LncRNA HOTTIP低表達組及對照組，每組設置6個復孔。見圖1。

1.3.4 采用CCK-8法測定細胞增殖能力? 取細胞懸液以10 000個/孔接種至96孔板中進行培養，使用酶標儀測定470 nm處的吸光度值。每組設置6個復孔。

1.3.5 采用CCK-8法觀察LncRNA HOTTIP對胃癌細胞存活的影響? 觀察各組的細胞存活率，每組設置6個復孔。

1.3.6 采用流式細胞儀檢測LncRNA HOTTIP對胃癌細胞凋亡的影響? 計算細胞凋亡率。每組設置6個復孔。

1.4 觀察指標

1.4.1 臨床病理資料收集? 收集胃癌患者的性別、年齡、分化程度（根據WHO病理組織學分類）[8]、TNM分期（Ⅱ、Ⅲ）（國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合委員會制定的TNM分期標準）[9]、腫瘤位置（胃體、胃竇、近端、多發）、淋巴結轉移（是、否）、腫瘤大小（≤5 cm、>5 cm）、侵襲深度（T1+T2+T3、T4）（以浸潤至黏膜或黏膜下層為T1，浸潤至肌層或漿膜下層為T2，腫瘤穿透漿膜層為T3，腫瘤直接侵及臨近組織或器官為T4）[10]、術后復發（是、否）等基本資料。

1.4.2 LncRNA HOTTIP表達水平檢測? 取患者胃癌組織及癌旁正常組織，采用實時熒光定量PCR法檢測患者胃癌組織LncRNA HOTTIP表達水平。

1.4.3 LncRNA HOTTIP表達水平與患者臨床病理資料的相關性? 比較胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達水平與患者臨床病理資料的相關性。

1.4.4 LncRNA HOTTIP表達水平與患者預后的相關性? 采用電話、復診等方法隨訪共10個月，建立Kaplan-Meier生存曲線，根據LncRNA HOTTIP對胃癌復發診斷的最佳截斷值分為LncRNA HOTTIP高表達組（n=67）與LncRNA HOTTIP低表達組（n=59），分析LncRNA HOTTIP表達水平與患者預后的相關性。

1.4.5 SGC7901細胞與SGC7901/DDP細胞中LncRNA HOTTIP表達水平檢測? 以SGC7901/DDP細胞作為SGC7901/DDP組，以胃癌細胞SGC7901作為SGC7901組，采用實時熒光定量PCR法檢測胃癌細胞SGC7901與耐藥胃癌細胞SGC7901/DDP中Lnc RNA HOTTIP表達水平。

1.4.6 細胞增殖能力及細胞存活率檢測? 采用CCK-8法觀察LncRNA HOTTIP低表達組及對照組細胞增殖能力及細胞存活率變化，分析LncRNA HOTTIP表達水平對胃癌細胞增殖能力及存活的影響。

1.4.7 細胞凋亡檢測? 采用流式細胞儀檢測LncRNA HOTTIP低表達組及對照組細胞凋亡變化，分析LncRNA HOTTIP表達水平對胃癌細胞凋亡的影響。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料比較采用t檢驗;LncRNA HOTTIP表達水平與患者預后的關系采用Kaplan-Meier生存曲線分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 126例胃癌臨床病理資料分析

126 例胃癌患者中，70.63%的患者分化程度較低，69.84%的患者TNM分期處于Ⅲ期，以胃竇處多發，大多數患者伴有淋巴結轉移，超過50%的患者侵襲深度為T4，且術后復發。見表2。

2.2 胃癌組織與癌旁正常組織中LncRNA HOTTIP表達水平

胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P<0.01）。見表3。

2.3 不同臨床病理的胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達水平

胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達水平與TNM分期、淋巴結轉移、侵襲深度及術后復發明顯相關（P<0.05），與性別、年齡、分化程度、腫瘤位置、腫瘤大小無明顯相關性（P>0.05）。見表4。

2.4 胃癌組織的LncRNA HOTTIP表達水平與胃癌患者預后的關系

建立ROC曲線，結果發現，LncRNA HOTTIP對胃癌復發診斷的最佳截斷值為2.52，以2.52為界分為LncRNA HOTTIP高表達組（n=67）與LncRNA HOTTIP低表達組（n=59）。建立Kaplan-Meier生存曲線，結果發現，LncRNA HOTTIP高表達組患者的生存期均明顯低于LncRNA HOTTIP低表達組患者。見圖2。

2.5 胃癌細胞與耐藥胃癌細胞的LncRNA HOTTIP表達水平

SGC7901/DDP組細胞的LncRNA HOTTIP表達水平明顯高于SGC7901組，差異有統計學意義（P<0.01）。見表5。

2.6 LncRNA HOTTIP表達水平對胃癌細胞增殖能力的影響

LncRNA HOTTIP低表達組的細胞增殖能力明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表6。

2.7 LncRNA HOTTIP表達水平對胃癌細胞存活的影響

隨著順鉑濃度的增加，細胞存活率明顯降低。LncRNA HOTTIP低表達組的細胞存活率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表7。

2.8 LncRNA HOTTIP表達水平對細胞凋亡的影響

LncRNA HOTTIP低表達組的細胞凋亡率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.001）。見表8。

3 討論

手術是治療胃癌的首選方法，但術后復發率高，易發生遠處轉移[11]。順鉑是胃癌化療的常用藥物，具有抗癌譜廣、療效確切的特點[12]。但腫瘤細胞耐藥性的出現增加患者的治療難度[13]?；熌退幮缘某霈F是一個復雜過程，可能是多種機制共同作用的結果[14]。LncRNA是一種多功能非編碼RNA，在轉錄起始、終止及核內運輸等重要進程中扮演重要角色[15]。有研究發現[16]，LncRNA在多種病理生理過程中發揮重要作用。HOTTIP為HOXA基因與遠端識別關鍵位點的控制元件，據報道[17]，其能夠通過激活其近端基因HOXA13從而參與多種腫瘤的增殖、凋亡甚至耐藥。本研究旨在探討LncRNA HOTTIP在胃癌D2根治術后腫瘤復發、耐藥及預后中的作用。

本研究發現，胃癌組織中LncRNA HOTTIP表達水平明顯升高，胃癌組織LncRNA HOTTIP表達水平與TNM分期、淋巴結轉移、侵襲深度及術后復發明顯相關。TNM分期、侵襲深度越高并伴有淋巴結轉移及術后復發的患者LncRNA HOTTIP越高。最后，本研究采用Kaplan-Meier生存曲線分析發現，LncRNA HOTTIP與患者生存預后明顯相關，LncRNA HOTTIP高表達組患者的生存期明顯低于LncRNA HOTTIP低表達組患者。LncRNA HOTTIP可以作為反映胃癌患者預后的重要指標[18]。

本研究采用SGC7901細胞建立順鉑耐藥細胞模型SGC7901/DDP，發現SGC7901/DDP組細胞LncRNA HOTTIP表達水平明顯高于SGC7901組（P<0.001）。LncRNA HOTTIP低表達組細胞的增殖能力及凋亡能力明顯強于對照組，存活率明顯低于對照組（P<0.05）。表明下調LncRNA HOTTIP的表達能夠明顯提高胃癌細胞對化療藥物的敏感性。這可能是因為調控LncRNA的表達能夠提高藥物在細胞內的聚集，從而增強藥物對腫瘤細胞的殺傷作用[19-20]。

綜上所述，LncRNA HOTTIP在胃癌組織中表達水平明顯升高，且其表達水平與患者的復發及預后明顯相關;經細胞實驗發現，下調LncRNA HOTTIP的表達能夠明顯抑制細胞增殖，抑制細胞活性，促進細胞凋亡，降低胃癌細胞的耐藥性，提高對化療藥物的敏感性。

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（收稿日期：2021-07-21）