子宮內膜非典型增生中TRF1、TRF2和H3K27me3的表達及意義

郭慧 譚麗珊 梁春燕 吳立琦 陳玉英

[摘要] 目的 探討端粒重復序列結合因子1（TRF1）、端粒重復序列結合因子2（TRF2）和組蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）免疫組化在子宮內膜非典型增生組織中的診斷作用。方法? 收集2016年3月至2018年11月廣東省韶關市第一人民醫院診斷的不伴子宮內膜非典型增生標本30例和子宮內膜非典型增生標本60例及子宮內膜樣癌30例。利用免疫組化SP法檢測TRF1、TRF2及H3K27me3在這些標本中的表達情況。結果? TRF1、H3K27me3、TRF2在子宮內膜非典型增生組中的表達率分別為35.00%（21/60）、43.33%（26/60）、71.67%（43/60），在不伴非典型子宮內膜增生組的表達率83.33%（25/30）、73.33%（22/30）、30.00%（9/30），在子宮內膜樣癌組中的表達率為30.00%（9/30）、36.67%（11/30）、76.67%（23/30）。子宮內膜非典型增生與不伴非典型子宮內膜增生表達率比較，差異有統計學意義（P<0.05）;子宮內膜非典型增生與子宮內膜樣腺癌表達率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論? 子宮內膜非典型增生TRF1及H3K27me3低表達，TRF2高表達，聯合TRF1、TRF2和H3K27me3有助于鑒別不典型子宮內膜增生與不伴有非典型子宮內膜增生，有助于子宮內膜非典型增生的早期診斷，推薦在常規病理工作中使用。

[關鍵詞] 子宮內膜非典型增生;TRF1;TRF2;H3K27me3;診斷

[中圖分類號] R364.3+1;R711? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）13-0001-03

[Abstract] Objective To investigate the effects of telomere repeat binding factor 1 （TRF1）， telomere repeat binding factor 2 （TRF2） and histone H3K27 trimethylation （H3K27me3） immunohistochemistry in the diagnosis of endometrial atypical hyperplasia tissues. Methods A total of 30 specimens without endometrial atypical hyperplasia， 60 specimens with endometrial atypical hyperplasia， and 30 specimens with endometrioid carcinoma were collected in Shaoguan First People′s Hospital in Guangdong Province from March 2016 to November 2018. The immunohistochemical SP method was used to detect the expressions of TRF1， TRF2 and H3K27me3 in these specimens. Results The expression rates of TRF1， H3K27me3， and TRF2 in the group with atypical endometrial dysplasia were 35.00% （21/60）， 43.33% （26/60）， and 71.67% （43/60）， respectively. The expression rates in the group without atypical endometrial hyperplasia were 83.33% （25/30）， 73.33% （22/30）， and 30.00% （9/30）， respectively. The expression rates in the group with endometrioid carcinoma were 30.00% （9/30）， 36.67% （11/30）， and 76.67% （23/30）， respectively. There were statistically significant differences in the expression rates between the group with atypical endometrial hyperplasia and the group without atypical endometrial hyperplasia （P<0.05）. There were no statistically significant differences in the expression rates between the group with atypical endometrial hyperplasia and the group with endometrioid carcinoma （P>0.05）. Conclusion TRF1 and H3K27me3 are low-expressed in endometrial atypical hyperplasia， and TRF2 is high-expressed. The combination of TRF1， TRF2 and H3K27me3 can help distinguish the group with endometrial atypical hyperplasia from the group without endometrial atypical hyperplasia， which is helpful in early diagnosis of endometrial atypical hyperplasia. It is recommended in routine pathological practice.4AB23247-607D-40CA-BF76-62F0E29BF349

[Key words] Endometrial atypical hyperplasia; TRF1; TRF2; H3K27me3; Diagnosis

子宮內膜非典型增生（endometrial atypical hyperplasia，EAH）是子宮內膜在無抵抗的雌激素刺激下過度增生，且被覆的腺上皮細胞失去極性出現非典型性。Kurman等[1]發現，在不伴子宮內膜非典型增生中，1.6%的病例進展為癌;而子宮內膜非典型增生進展為癌的風險為15%～28%[1-2]。其中年輕患者約占1%～15%，大多是早期子宮內膜樣腺癌，而高達70%的育齡期患者確診時仍未生育[3];其他子宮內膜增生患者無一例發生癌變。近年來越來越多的有生育要求的EAH患者，希望在病變緩解后實現生育。因此，判斷子宮內膜是否具有非典型性以及EAH的早診斷、早治療的意義就很重要。本研究運用免疫組織化學染色技術探討TRF1，TRF2和H3K27me3在不伴子宮內膜非典型增生、子宮內膜非典型增生、子宮內膜樣癌中的表達情況，旨在尋找子宮內膜非典型增生的早期篩查方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2016年3月至2018年11月廣東省韶關市第一人民醫院診斷性刮宮或子宮切除標本120例，其中不伴子宮內膜非典型增生30例，年齡40～65歲，子宮內膜非典型增生60例，年齡25～55歲，子宮內膜樣癌30例，年齡53～67歲。所有標本術前3個月均未接受放化療及激素治療，診斷結果均由2名高級職稱的病理醫師雙盲確診一致。所有納入本課題的對象均知情同意，且通過醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑

TRF1，TRF2購于美國Abcam公司，TRF1的批號為20114010G，TRF2的批號為20114020G，鼠抗人Histone H3K27me3單克隆抗體購于廈門通靈生物醫藥科技有限公司，批號為：20715391G，三種抗體均為稀釋液（即用型）。

1.3 免疫組化及判定結果

所有組織均經常規石蠟包埋、組織切片，采用免疫組織化學Sp法檢測組織中的TRF1，TRF2，H3K27me3表達。判定結果：TRF1蛋白在子宮內膜細胞漿中表達，TRF2蛋白在子宮內膜細胞漿及細胞核中均不同程度表達，H3K27me5在子宮內膜細胞核中表達。再根據陽性細胞百分比及染色強度分別計分判定TRF1、TRF2、H3K27me3的染色結果：①陽性染色強度：0分無染色，1分淡黃色，2分棕黃色，3分棕褐色;②陽性細胞比例：0分≤10%;1分 11%～50%;2分51%～75%，3分>75%。兩者相乘后積分：0分（-）、1～2分（+）、3～4分（++），5～9分（+++）。免疫組化結果見封三圖1～9。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，相關性分析應用Spearman秩相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRF1、TRF2、H3K27me3在不同子宮內膜中的表達

不伴子宮內膜非典型增生的TRF-1、H3K27me3陽性表達率分別為83.33%、73.33%，明顯高于在子宮內膜非典型增生（35.00%、43.33%）與子宮內膜樣癌（30.00%、36.67%）中的表達，差異均有統計學意義（P<0.01）。不伴子宮內膜非典型增生的TRF2陽性表達率為30.00%，明顯低于在子宮內膜非典型增生（71.67%）與子宮內膜樣癌（76.67%）中的表達，差異均有統計學意義（P<0.001）。子宮內膜非典型增生的TRF1、TRF2、H3K27 me3陽性表達率分別為35.00%、71.67%、43.33%，與子宮內膜樣癌的陽性表達率（30.00%、76.67%、36.67%）比較，差異均無統計學意義（P=0.635，P=0.613，P=0.545）。見表1。

2.2 不伴子宮內膜非典型增生與子宮內膜非典型增生中TRF1、TRF2蛋白表達的相關性

Spearman相關分析顯示：在30例不伴子宮內膜非典型增生中，TRF1、TRF2蛋白表達呈負相關性（rs=-0.462，P<0.05）。而在60例子宮內膜非典型增生中，TRF1、TRF2蛋白表達呈負相關性（rs=-0.509，P<0.05）。見表2～3。

2.3 在子宮內膜非典型增生組中H3K27me3表達與TRF1、TRF2蛋白表達的關聯分析

Peasrson卡方檢驗顯示，60例子宮內膜非典型增生組中，H3K27me3表達陽性與TRF1蛋白陽性存在正性關聯（χ2=34.32，r=0.763，P<0.001），H3K27me3表達陽性與TRF2蛋白陽性表達存在負性關聯（χ2=11.37，r=-0.439，P<0.01）。

3 討論

子宮內膜非典型增生（EAH）作為子宮內膜樣癌（endometrioid carcinoma，EC）的前驅病變，兩者在分子遺傳學水平上表現為一個疾病的連續性不同階段[4]。據報道，子宮內膜樣癌的發生，遵循從不伴子宮內膜非典型增生（endometrial hyperplasia，EH）→子宮內膜非典型增生/子宮內膜上皮內瘤變（endometrial intrepithelial neoplasia，EIN）→子宮內膜樣癌的過程[5]?，F在子宮內膜非典型增生患者越來越多，年齡越來越年輕，有統計顯示約3%～5%的患者年齡在40歲以下[6]。因此早期發現子宮內膜非典型增生非常必要。本研究通過H3K27me3、TRF1、TRF2蛋白在子宮內膜非典型增生中的不同表達，可早期診斷EAH，從而為臨床醫生對子宮內膜非典型增生的早期預防和治療提供依據，具有重要的臨床實用價值。4AB23247-607D-40CA-BF76-62F0E29BF349

分子生物學研究表明端粒是由重復的TTAGGG序列及端粒結合蛋白所組成，其功能是確保阻止內源性或外源性因子對染色體結構的破壞，阻止細胞凋亡引起的染色體損傷，從而維持染色體的完整性[7]。細胞端粒功能異常是導致細胞異變，繼而引發癌癥發生的重要原因[8-9]。

TRF1和TRF2是兩種不同的端粒結合因子。TRF1通過與端粒DNA末端的特異性結合來改變端粒的結構，從而以順式作用方式抑制端粒酶與端粒的結合，達到阻止端粒延長的目的，影響細胞的癌變[10]。TRF2能夠保持端粒長度動態平衡，保持端粒結構穩定，正性影響細胞癌變進程。國外研究表明，惡性腫瘤組織TRF1的表達明顯降低，而TRF2較正常組織明顯增高[11]。趙鵬等[12]發現胃癌組織中TRF2蛋白表達較正常胃黏膜組織增高，TRF1蛋白表達較正常胃黏膜組織降低。陳向等[13]的研究表明，TRF2在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，TRF1在肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織。國內在肝癌、宮頸癌及胃癌等腫瘤與TRF1、TRF2的相關性研究中大多也得出類似結果：TRF1蛋白在癌前病變和癌組織中的表達低于正常組織及癌旁組織; TRF2蛋白在癌前病變和癌組織中的表達高于正常組織及癌旁組織。研究發現，子宮內膜非典型增生中的TRF2表達明顯增高，TRF1表達降低。TRF1蛋白表達的降低可能與端粒酶的激活有關，較少的TRF1蛋白允許更多的端粒酶接近端粒DNA以延長縮短的端粒，而TRF2蛋白表達的上調則參與了端粒長度的負性調節和結構的維持;TRF1、TRF2表達的改變共同作用于端粒的動態平衡，從而導致子宮內膜不典型增生。

表觀遺傳是在基因的DNA序列不發生變化的條件下，基因功能發生可遺傳的變化，其主要發生機制包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調控、染色質結構重構等[14]。組蛋白H3K27me3的修飾是表觀遺傳中重要的基因沉默標志，參與調節細胞分化與增殖之間的平衡，其表達失衡可導致細胞增殖分化失控，進而導致腫瘤的發生[15-16]。H3K27me3由多梳抑制復合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）產生，PRC2由EZH2、胚胎外胚層發育蛋白（embryonic ectoderm development，EED）和胚胎肝細胞抑制蛋白（suppressor of zeste，SUZ12）三部分核心亞基組成。PRC2的改變會導致H3K27me3表達失衡。WEI等[17]發現在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者中H3K27me3的表達缺失。本研究發現，H3K27me3在不伴子宮內膜非典型增生組織中高表達，而在子宮內膜非典型增生組織中低表達，表達缺失。H3K27me3的表達缺失，可能是EZH2通過抑制E-鈣黏蛋白的表達，進一步喪失催化H3K27三甲基化的能力，引起H3K27me3表達水平下調，從而導致腫瘤的發生。

綜上所述，TRF1、H3K27me3在子宮內膜非典型增生中低表達，明顯低于不伴子宮內膜非典型增生，而TRF2在子宮內膜非典型增生中高表達，明顯高于不伴子宮內膜非典型增生。TRF1與TRF2在子宮內膜非典型增生中呈負相關，二者通過負向調控促進子宮內膜非典型增生病變的發生發展。H3K27me3在非典型子宮內膜增生中低表達。通過三者的聯合檢測，可以早期發現子宮內膜非典型增生的患者，從而指導臨床早期治療，降低患者的癌變率。因本研究選取樣本量較少，三者在腫瘤的發生中的相互作用有待進一步研究。

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（收稿日期：2021-08-23）4AB23247-607D-40CA-BF76-62F0E29BF349