5-脂氧合酶激活蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及臨床意義

李 玲，白春英，張俊毅，史鐵偉，馬迎平

(1.錦州醫科大學赤峰學院研究生培養基地，內蒙古 赤峰 024099；2.赤峰市醫院感染科，內蒙古 赤峰 024099；3.內蒙古人類遺傳病研究重點實驗室，內蒙古 赤峰 024099；4.赤峰學院附屬醫院病理科，內蒙古 赤峰 024099；5.赤峰市醫院肝膽外科，內蒙古 赤峰024099)

手術雖是食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的首選治療手段，但僅可清除ESCC患者已生成的腫瘤組織，術后仍有較高的轉移、復發風險，不僅影響整體的手術治療效果，部分患者甚至面臨二次手術風險，治療難度加大，可增加患者病死風險[1-2]。研究[3]證實，多數ESCC患者預后欠佳，生存率低下，且患者的預后和生存情況與其TNM分期、淋巴結轉移等密切相關。因而，早期預估復發轉移風險并指導治療對減少復發轉移、改善預后意義重大。有研究[4]指出，花生四烯酸與白三烯等脂類物質代謝異常在ESCC的發生、發展中發揮關鍵性作用，脂代謝通路上的酶及其代謝產物可介導炎癥反應、促進腫瘤細胞增殖等因素均可能參與了ESCC發生的病理過程。5-脂氧合酶激活蛋白(Five lipoxygenase activating protein，FLAP)是花生四烯酸與白三烯等脂類物質代謝通路中關鍵的酶[5]。有研究[6]指出，FLAP的基因位點突變與腫瘤的發生密切相關，同樣，FLAP的表達抑制也可誘導腫瘤細胞發生凋亡。結合上述信息，推測FLAP在ESCC患者中也有一定的表達，且可能與疾病臨床病理特征有一定關系。因此，本研究主要觀察ESCC患者癌組織內FLAP表達情況，分析FLAP表達與ESCC及其臨床病理特征的關系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2007年1月至2011年1月期間就診于赤峰學院附屬醫院并經胃鏡、手術病理等檢查確診為ESCC的297例患者癌組織標本，并選取其中66例患者的癌旁相對正常的食管組織標本。297例患者中，男性232例，女性65例；年齡57～61歲，中位數59(58，60)歲；腫瘤直徑2.4～11.25 cm，平均(6.87±1.03)cm；TNM分期[7]中，Ⅰ期28例，Ⅱ期136例，Ⅲ期133例，Ⅳ期0例；高分化45例，中分化227例，低分化25例；發生淋巴結轉移147例。病例納入標準：①符合《中國早期食管鱗狀細胞癌及癌前病變篩查與診治共識(2015年·北京)》[8]中ESCC相關診斷標準，并均經影像學、病理學檢查確診；②均接受手術治療；③預計生存時間>3個月。排除標準：①其他惡性腫瘤者；②術前接受放、化療者；③既往有胸部手術史，且有胸腔粘連者；④有精神障礙或心理疾病，無法配合研究內相關檢查者；⑤合并全身感染性、自身免疫性疾病者；⑥伴有中樞神經系統廣泛性轉移者。所有患者對本研究知情且同意。本研究已通過醫院倫理委員會審批。

1.2 研究方法

1.2.1 標本制備：全部患者均通過手術采取食管癌組織及癌旁組織標本(即距腫瘤邊緣>5 cm的食管組織)。將選取的石蠟切片連續切片(4 μm)，每張石蠟塊切4張片，經蘇木精染色，漂白后干燥。

1.2.2 免疫組織化學染色：使用FLAP抗體(批號：CA92124，美國abgent公司，稀釋滴度為1∶100)、超高分子檢測試劑盒和液體基質試劑盒(美國Invitrogen公司)進行免疫組化染色。石蠟切片脫蠟至水，使用3%過氧化氫-甲醇封閉30 min，并采用檸檬酸緩沖液進行漂洗。漂洗10 min后進行抗原修復。使用3%過氧化氫溶液處理10 min，去除內源性過氧化物酶，在FLAP抗體濕盒中孵育過夜，二氨基聯苯胺顯色，再使用蘇木精復染，最后使用光學顯微鏡進行觀察及顯微圖像攝影。判定標準包括依據染色強度和依據癌組織中陽性細胞數兩種。依據染色強度：無染色，0分；弱染色，1分；中度染色，2分；強染色，3分。依據癌組織中陽性細胞數：<5%，0分； 5%～25%，1分； 26%～50%，2分； 51%～75%，3分；>75%，4分。將染色強度和癌組織中陽性細胞數的分數相乘得出最終評分：0～2分表示FLAP低表達，即陰性；3～12 分表示FLAP高表達，即陽性。

2 結 果

2.1 ESCC患者癌旁組織和癌組織FLAP陽性率比較 297份ESCC組織標本中，有223例FLAP呈陽性表達，陽性率為75.08%；66份癌旁組織標本中，有13例FLAP呈陽性，陽性率為19.70%。ESCC組織標本FLAP陽性率高于癌旁組織標本(χ2=72.830，P<0.05)。ESCC患者癌旁組織和癌組織免疫組化染色結果見圖1。

2.2 不同臨床病理特征ESCC患者FLAP陽性率比較 見表1。腫瘤細胞轉移擴散患者的FLAP陽性率高于腫瘤細胞未轉移擴散患者，TNM Ⅲ期患者的FLAP陽性率高于Ⅰ-Ⅱ期患者，低分化患者的FLAP陽性率低于中、高分化患者(均P<0.05)。中、高分化患者間以及Ⅰ、Ⅱ期患者間的FLAP陽性率比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。

2.3 FLAP陽性表達與ESCC患者不同臨床病理特征的相關性分析 見表2。經Kendall相關性檢驗， ESCC患者腫瘤細胞轉移擴散、TNM分期與FLAP陽性表達呈正相關，分化程度與FLAP陽性表達呈負相關(均P<0.05)。

A：FLAP在癌旁組織中陽性表達；B：FLAP在ESCC組織中弱陽性表達；C：FLAP在ESCC組織中陽性表達；D：FLAP在ESCC組織中強陽性表達

表1 不同臨床病理特征ESCC患者FLAP陽性率比較[例(%)]

表2 FLAP陽性表達與ESCC患者不同臨床病理特征的相關性

3 討 論

文獻[9]指出，ESCC患者術后生存率較低，原因可能與術后腫瘤細胞復發、轉移和擴散等有關。因此，尋找可反映ESCC預后的相關指標對指導后期治療方案的擬定、改善預后、延長生存時間具有積極意義。

研究[10-11]發現，ESCC的發生、發展與炎癥反應、酶代謝通路等相關。花生四烯酸代謝通路的代謝產物為白三烯。白三烯是一種炎癥刺激因子，不僅可促進黏液分泌，還可促進平滑肌收縮，增加血管通透性，同時可使白細胞聚集，促進纖維細胞的增殖，在炎癥反應過程中發揮關鍵性作用[12]。FLAP是花生四烯酸代謝通路中的一個關鍵酶，可借助激活5-脂氧合酶(5-LO)，同時給5-LO提供底物，將花生四烯酸呈遞給5-LO，繼而生成5-氫過氧化二十碳四烯酸，促進白三烯A4的合成與分泌，同時可通過水解酶和合成酶作用產生白三烯B4、 白三烯C4、白三烯D4和白三烯E4[13-14]。并且FLAP可誘導細胞內蛋白酪氨酸磷酸化，促進腫瘤細胞增殖病情進展[15]。同時，MEK/MAPK信號途徑可抑制細胞凋亡，而FLAP可通過磷酸化MEK/MAPK促進腫瘤細胞增殖，進一步促進病情進展[16]。結合FLAP的特點，推測FLAP與ESCC的發生、發展存在某種關系。

本研究結果顯示，ESCC組織標本中的FLAP陽性率高于癌旁組織標本，腫瘤細胞轉移擴散和TNMⅢ期患者的FLAP陽性率均高于腫瘤細胞未轉移擴散和Ⅰ-Ⅱ期的患者，低分化患者的FLAP陽性率低于中高分化患者，初步提示FLAP陽性表達在ESCC患者不同組織間存在差異，且FLAP陽性表達與腫瘤細胞轉移擴散、TNM分期及分化程度相關。究其原因，FLAP可提高基質金屬蛋白酶-2活性，促進血管內皮生長因子表達，從而刺激新生血管形成，促進腫瘤的發生、發展[17]。并且，FLAP可促進白三烯A4、白三烯B4等代謝產物的合成與分泌，繼而增強細胞的氧化應激，促進炎癥反應，進一步促進腫瘤的發生與發展[18-19]。但研究結果顯示，隨著分化程度的降低，FLAP的陽性表達升高，該結果與FLAP在高分期、腫瘤細胞轉移擴散中的強陽性表達有一定差異，可能與本研究納入患者的分化情況多集中于中、高分化有關，因此關于FLAP在不同分化程度ESCC患者中的表達情況仍需未來進一步開展研究進行分析[20-21]。最后，本研究分析了FLAP與ESCC不同臨床病理特征的關系，雙變量Kendall直線相關性檢驗結果顯示，ESCC患者的腫瘤細胞轉移擴散和TNM分期與FLAP陽性表達均呈正相關，分化程度與FLAP陽性表達呈負相關，從而證實了前述猜測。

綜上所述，與癌旁組織相比，FLAP在ESCC組織中的表達顯著增強，且ESCC患者癌組織中的FLAP陽性表達與TNM分期、腫瘤細胞轉移擴散及分化程度有關。因此，建議臨床可通過穿刺活檢測定ESCC患者癌組織中FLAP表達，以輔助評估患者分期、轉移及分化等情況。