和厚樸酚對缺氧心肌細胞的保護作用及機制研究

郭艷杰，劉乃溶，于心悅，王夢柳，王 博

(1.西安國際醫學中心醫院心臟內科，陜西 西安 710100；2.西安國際醫學中心醫院醫教部，陜西 西安 710100；3.空軍軍醫大學西京醫院心臟內科，陜西 西安 710032)

心肌梗死(Myocardial infarction，MI)是冠狀動脈疾病的復雜表型之一，是多種遺傳和環境因素相互作用的結果[1]。盡管醫學技術的進步已經使得MI后患者病死率下降，但近年來MI后心力衰竭的發生率和患病率仍然在不斷增加。MI后5年病死率仍高達為30%～70%[2]。MI后的心臟保護研究策略仍然迫切。和厚樸酚(Honokiol，HK)是從廣玉蘭球果中提取的天然雙酚類化合物，在中藥中得到了廣泛的應用。HK對卵巢、腎臟、大腦、心臟等顯示出確切的保護作用[3-4]。然而，HK對缺氧的心肌細胞是否具有保護作用及其機制尚不清楚。研究[5-6]報道，去乙酰化酶沉默信息調節因子3(Silence information regulator 3，SIRT3)在各種心血管疾病的發病機制中發揮關鍵作用，包括缺血性心臟病、心肌肥厚、心力衰竭、糖尿病心肌病、心臟脂毒性、藥物誘導的心臟毒性和MI。據報道[7]，MI時SIRT3表達水平會顯著降低。動物模型中SIRT3基因敲除會增加缺血引起的梗死面積，加重缺血再灌注引起的心肌損傷[8]。SIRT3下調也擾亂了正常心臟功能。SIRT3已經被證明能去乙酰化并激活主要的超氧化物自由基清除劑(Manganese superoxide dismutase，SOD2)，從而減少活性氧的產生和對氧化應激誘導的細胞損傷的保護反應[9]。除此之外，一些研究還關注SIRT3表達對細胞凋亡的影響，雖然具體機制存在爭議，但是SIRT3顯然是心肌細胞凋亡的有效抑制劑。HK是使用非常廣泛的SIRT3激活劑之一，能夠增加SIRT3表達和去乙酰化活性，預防心臟病[10]。因此，本研究探究HK對缺氧心肌細胞的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生1～2 d的SD大鼠仔鼠60只，不分雌雄，體重5～7 g，購買于空軍軍醫大學實驗動物中心。本研究經西安國際醫學中心動物福利倫理委員會審核并批準。

1.2 主要試劑 HK(貨號：H111271)購自上海阿拉丁生化科技公司；CCK-8試劑盒(貨號：C008-3)購自上海七海復泰生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(貨號：A020-2-2)購自南京建成生物工程研究所；TUNEL試劑盒(貨號：11684795910)購自美國Roche公司；膠原酶Ⅰ和DAPI購自美國Sigma公司；胎牛血清和F12培養基購買自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SIRT3短發夾RNA(ShRNA，597位點)慢病毒及其對照病毒Scramble購自上海基因制藥有限公司；Bax(貨號：50599-2-Ig)、Bcl-2(貨號：26593-1-AP)、GAPDH(貨號：60004-1-Ig)、SOD2(貨號：24127-1-AP)、SIRT3(貨號：10099-1-AP)購自武漢三鷹生物技術有限公司；Ac-SOD2(貨號：ab137037)購買自美國Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳鼠原代心肌細胞提取及培養：取新生SD大鼠仔鼠心臟，切成小塊。將碎片組織在含有1%膠原酶Ⅰ的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中消化。以每毫升5×105個細胞的密度接種，培養基為含10%胎牛血清、0.1 mmol/L溴脫氧尿苷(BrdU)、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 U/ml)的DME/F-12培養基，CO2含量5%，37 ℃培養48 h后開始使用。

1.3.2 模型建立及分組：用Hanks平衡鹽溶液代替正常培養基，并將心肌細胞置于Napco中8000 WJ缺氧培養箱(5% CO2和95% N2)中8 h。HK處理組在缺氧的同時加入HK，最終濃度為10 μmol/L。在HK對心肌細胞保護作用實驗中，原代心肌細胞分為Nor+DMSO組(常氧組)、Nor+HK組(對照+HK組)、Hypo+DMSO組(缺氧組)以及Hypo+HK組(缺氧+HK組)。在驗證SIRT3是HK保護缺氧心肌細胞關鍵信號分子的實驗中，原代心肌細胞分為Hypo+Scramble+DMSO組(缺氧+對照病毒組)、Hypo+Scramble+HK組(缺氧+對照病毒+HK組)、Hypo+ShRNA+DMSO組(缺氧+SIRT3干擾慢病毒組)以及Hypo+ShRNA+HK組(缺氧+SIRT3干擾慢病毒+HK組)。

1.3.3 細胞活力檢測：將細胞與5 mg/ml CCK-8在CO2培養箱中培養1 h。去掉培養基后在460 nm波長和630 nm參考波長下，通過酶標儀測量每個孔的吸光度。光密度(OD)作為細胞存活率的指標。

1.3.4 TUNEL染色：心肌細胞培養和處理后棄去原有培養基，PBS清洗后用4%多聚甲醛固定，按照試劑盒說明書進行TUNEL染色，使用Image J軟件計算凋亡細胞百分比。

1.3.5 慢病毒轉染：在含有5 μg/ml聚凝胺的培養基中，用SIRT3 ShRNA慢病毒或陰性對照以100倍感染率轉染原代心肌細胞。慢病毒攜帶綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因，倒置顯微鏡下觀察呈現綠色的細胞，確認感染效率。

1.3.6 蛋白質免疫印記：心肌細胞用經過37 °C水浴的PBS漂洗后，加入RIPA裂解液，將細胞刮下并裂解，離心后得到蛋白樣品。蛋白樣品濃度用BCA法進行檢測定量。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、提取和定量蛋白質并將其轉移到PVDF上。用含5%脫脂奶粉和0.1%吐溫-20的封閉液室溫下封閉PVDF膜2 h。隨后將PVDF膜與適當的一抗抗體在4 °C下孵育過夜。室溫條件下用相應的辣根過氧化物酶結合二抗孵育PVDF膜。添加增強化學發光(ECL)試劑，用Chemi DocTMXRS進行成像，使用與成像儀配套的Image Lab 5.0軟件對蛋白條帶進行相對定量分析。

2 結 果

2.1 各組心肌細胞活力及LDH釋放比較 見圖1。缺氧后心肌細胞活力下降了37.46%，給予HK后缺氧心肌細胞活力升高(均P<0.01)。缺氧處理后，心肌細胞LDH釋放由(12.02±2.34)%上升至(42.35±2.89)%，但給予HK之后LDH釋放量下降至(28.45±3.12)%。

注：與Hypo+DMSO組比較，#P<0.01，△P<0.001

2.2 各組心肌細胞凋亡率比較 見圖2。缺氧后心肌細胞凋亡率增加，經過HK處理后心肌細胞凋亡率從(37.88±2.94)%下降到(20.51±3.87)%(均P<0.05)。

注：A圖為各組心肌細胞TUNEL染色結果(×40)；B圖中，與Hypo+DMSO組比較，*P<0.05，△P<0.001

2.3 各組心肌細胞凋亡分子表達比較 見圖3。缺氧處理后，心肌細胞Caspase-3活性提高了2.57倍，而HK處理后缺氧心肌細胞Caspase-3活性下降了26.96%(均P<0.05)。同樣，缺氧后Bcl-2/Bax比值下降了65.98%，而HK處理使得該比值上升了1.05倍(均P<0.05)。缺氧后Ac-SOD2/ SOD2比值升高了86.32%，而HK處理使得該比值下降了26.33%(均P<0.05)。SIRT3在缺氧后表達量下降，而HK使得SIRT3表達量升高了1.73倍(均P<0.05)。

2.4 SIRT3分子干擾后各組心肌細胞活力比較 見圖4。SIRT3分子被干擾后，HK處理后的缺氧心肌細胞活力與未處理的缺氧心肌細胞活力比較差異無統計學意義[(94.01±2.51)%與(98.36±3.76)%，P>0.05]。SIRT3分子被干擾后，HK處理后的缺氧心肌細胞活力與未處理的缺氧LDH釋放比較差異無統計學意義[(48.57±6.07)%與(52.37±5.55)%，P>0.05]。

2.5 SIRT3分子干擾后各組心肌細胞凋亡率比較 見圖5。SIRT3分子干擾后，缺氧后心肌細胞凋亡率為(50.35±3.96)%，HK處理后心肌細胞凋亡率為(46.84±2.97)%，但兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.6 SIRT3分子干擾后各組心肌細胞凋亡分子表達比較 見圖6。SIRT3分子干擾后，經過HK處理的缺氧心肌細胞中Caspase-3活性與未處理的缺氧心肌細胞中Caspase-3活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。同樣，HK處理也不能改變缺氧心肌細胞中Bcl-2/Bax比值(P>0.05)。SIRT3分子干擾后缺氧心肌細胞中Ac-SOD2/SOD2相對比值為1.150±0.089，而HK處理后該相對比值為0.987±0.075，兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)。

注：與Hypo+DMSO組比較，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

注：與Hypo+Scramble+DMSO組比較，*P<0.05，△P<0.001，ns表示差異無統計學意義

3 討 論

廣玉蘭植物屬于木蘭屬，在我國、日本和亞洲其他地區被用作中藥。HK提取自廣玉蘭植物，是一種多效木脂素，具有辛辣和芳香氣味。HK具有廣泛的治療作用，如抗抑郁、抗菌、抗腫瘤、抗血栓、抗痙攣和神經保護等作用。HK已被證實對神經退行性疾病、糖尿病、心血管疾病和癌癥等氧化應激和炎癥所致疾病有效[3]。心血管疾病方面，已經有研究報道，HK能夠減少氧化應激減輕1型糖尿病心肌缺血再灌注損傷；通過增強自噬流和減少胞內活性氧產生改善心肌缺血/再灌注損傷[10-11]。此外，研究還表明HK通過降低氧化壓力改善美洲錐蟲病引起的心功能紊亂；改善糖尿病小鼠線粒體底物利用和細胞脂肪酸代謝；通過抑制組蛋白脫乙酰基酶6(HDAC6)介導的胱硫氨酸γ-裂解酶降解，改善血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓和內皮功能障礙；通過激活線粒體SIRT3阻止和逆轉壓力超負荷引起的心肌肥厚；通過SIRT3保護線粒體，從而保護小鼠心臟免受阿霉素誘導的心肌病[12-16]。

注：A圖為各組心肌細胞TUNEL染色結果(×40)；B圖中，與Hypo+Scramble+DMSO組比較，#P<0.01，ns表示差異無統計學意義

注：與Hypo+Scramble+DMSO組比較，*P<0.05，△P<0.001，ns表示差異無統計學意義

盡管目前HK在心血管疾病方面已經有了諸多報道，但是目前尚未有關于HK對缺氧心肌細胞保護的報道。本研究證實，HK具有抗心肌細胞缺氧損傷的作用：給予HK后，缺氧原代心肌細胞的細胞活力升高，LDH釋放增加，細胞凋亡率下降，Caspase-3活性降低，Bcl-2/Bax比值上升。進一步的研究表明，HK降低了SOD2的乙酰化水平，提高了SIRT3的表達水平。

Sirtuins是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的Ⅲ類組蛋白脫乙酰酶家族[17]。Sirtuins家族在哺乳動物中存在7個成員，也就是SIRT1至SIRT7。這些Sirtuins分布在不同的亞細胞位置，即細胞質(SIRT1/2)、線粒體(SIRT3/4/5)和細胞核(SIRT1/2/6/7)[18]。Sirtuins調節許多細胞過程，包括晝夜節律、代謝、基因轉錄、細胞周期和凋亡[19-20]。越來越多的證據表明，SIRT3在心血管疾病的發展中起著關鍵作用[21-23]。在人類和小鼠中，SIRT3在腎臟、心臟、大腦、棕色脂肪組織和肝臟等高度代謝的組織和器官中高度表達[24]。SIRT3具有多種酶活性，包括脫乙酰基酶、腺苷二磷酸核糖基酶、五二糖和去琥珀酸基酶[24]。SIRT3活性的多樣性反映在其參與調節各種生物過程，包括ATP生成、分解代謝和活性氧解毒[25]。此外，研究[26]表明，SIRT3在調節細胞死亡、血管生成、自噬和代謝穩態中發揮重要作用。SIRT3與許多嚴重疾病有關，包括肝細胞癌、糖尿病和特發性肺纖維化[27-28]。HK是從木蘭樹皮中提取的天然木脂素，是使用最廣泛的SIRT3激活劑之一。HK增加SIRT3表達和去乙酰化活性，預防心臟病[10]。許多其他天然產物(如虎杖苷、白藜蘆醇和大黃素)已被證明能夠正向調節SIRT3的表達和活性。此外，褪黑素對心臟病的保護作用歸因于其激活SIRT3的能力，鎘降低了SIRT3蛋白的表達和活性，褪黑素則逆轉了鎘介導的SIRT3活性下降，但是不影響SIRT3的表達。本研究發現，HK能夠提高缺氧心肌細胞的活力，減輕心肌細胞的損傷；減少缺氧后心肌細胞的凋亡；抑制缺氧心肌細胞凋亡相關分子的表達。而心肌細胞中SIRT3分子被干擾后，缺氧組與治療組之間的心肌細胞活力、心肌細胞損傷、心肌細胞凋亡和胞內凋亡相關分子的表達比較差異均無統計學意義，這表明HK是通過SIRT3信號通路發揮對缺氧心肌細胞的保護作用。

綜上所述，厚樸酚通過SIRT3發揮抗心肌細胞缺氧損傷作用：給予HK后，缺氧原代心肌細胞活力升高，LDH釋放增加，細胞凋亡率下降，Caspase-3活性下降，Bcl-2/Bax比值上升；慢病毒干擾SIRT3表達以后，再給予HK與未給予HK相比，在細胞活力、LDH釋放、凋亡率、Caspase-3活性、Bcl-2/Bax比值及SOD2乙酰化水平等方面比較差異均無統計學意義。本研究發現了HK潛在的應用價值，可能為臨床治療MI及保護梗死后心臟提供了潛在的新藥物，但是實現臨床轉化還需要開展更多的動物、臨床及機制研究。