沉默信息調節因子2同系物1在人瘢痕疙瘩組織中的表達及其與氧化應激指標相關性研究

霍君藝，趙卓偉，段策中，華 振，荊銀磊，孟祥海

(空軍軍醫大學唐都醫院燒傷整形科，陜西 西安 710038)

瘢痕疙瘩是皮膚傷口愈合或不明原因所致皮膚損傷愈合后所形成的過度生長的異常瘢痕組織，其通常表現為病變部位超出原始皮膚損傷范圍，并呈現可持續性生長特征，主要形狀為結節狀、條索狀或片狀[1-2]。目前，根據大小可將其分為小型瘢痕疙瘩(直徑<2.0 cm)、中大型瘢痕疙瘩(長度2.0～10.0 cm，寬度<5.0 cm)和超大型瘢痕疙瘩(長度>10.0 cm，寬度≥5.0 cm)。對于不同類型的瘢痕疙瘩，采取不同的治療手段，主要包括藥物治療、手術治療和放射治療[3-4]。然而，由于瘢痕疙瘩發病機制目前尚未明確，難以被治愈，因此研究瘢痕疙瘩的發病機制對開發瘢痕疙瘩的新療法意義重大。沉默信息調節因子2同系物1(Silent information regulator 2 homologue 1，SIRT1)是一種在人體各種組織廣泛表達的蛋白質。同時，SIRT1作為Sirtuin家族的重要成員，也是一種組蛋白去乙酰化酶，可以通過對多種組蛋白的調控而參與細胞增殖、分化、凋亡和死亡的調控[5-6]。研究[7]發現，SIRT1-SIRT3-SOD2-mROS依賴性自噬通路與基于5-氨基乙酰丙酸的光動力療法治療瘢痕疙瘩的臨床療效有關。此外，SIRT1有希望成為肥厚性瘢痕的治療靶點[8]。然而，目前關于SIRT1在瘢痕疙瘩組織中的表達報道較少。鑒于此，本研究通過實時熒光定量PCR(qPCR)法和免疫印跡法檢測人瘢痕疙瘩組織中SIRT1基因表達，并探討SIRT1表達與氧化應激指標的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年12月在我院接受治療的瘢痕疙瘩患者82例，其中男性49例，女性33例；年齡22～63歲，平均(45.36±9.82)歲；胸部39例，腹部25例，肩部10例，耳后8例；病程3～16個月，平均(8.91±1.02)個月。病例納入標準：①所有患者均未服用瘢痕抑制類藥物治療；②臨床病理診斷無惡變；③瘢痕組織未行物理治療；④患者均知情同意。排除標準：①合并皮膚疾病；②合并惡性腫瘤或傳染性疾病；③瘢痕組織局部出現感染。本研究已通過醫院倫理委員會審批。

1.2 研究方法 根據病程不同將82例瘢痕疙瘩患者分為A組(0～6個月，30例)、B組(6～12個月，27例)和C組(>12個月，25例)。每份瘢痕疙瘩組織標本根據生長期分為浸潤部、增生部和老化部，并且每份瘢痕疙瘩組織取正常皮膚組織1份作為對照。檢測每位患者正常組織和瘢痕疙瘩組織(浸潤部、增生部和老化部)中SIRT1基因表達情況，取多次檢測的平均值。此外，檢測正常組織和瘢痕疙瘩組織p65蛋白和p-p65蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)以及晚期氧化蛋白產物(AOPP)水平。

1.2.1 SIRT1 mRNA表達檢測：通過組織RNA提取試劑盒(批號：R218，北京金百特生物科技有限公司)提取正常組織和瘢痕疙瘩組織總RNA，然后使用反轉錄試劑盒(批號：205111，北京凱幕生物科技有限公司)將提取的RNA反轉錄為cDNA，最后按照qPCR試劑盒(批號：LS-0064，重慶唯尚立德生物科技有限公司)說明書配置反應體系以檢測SIRT1 mRNA表達。SIRT1正向引物序列為5’-GGCTCTATACACAGAACATCGAC-3’，反向引物序列為5’-ATCATCGGCATTTTGAACGAGG-3’。內參β-actin正向引物序列為5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’， 反向引物序列為5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATG-3’。

1.2.2 SIRT1、p65和p-p65蛋白表達檢測：通過組織蛋白提取試劑盒(批號：BB-3122-2，北京安鑫康科技有限公司)提取正常組織和瘢痕疙瘩組織總蛋白，然后采用BCA試劑盒(批號：23227，北京科創欣達科技有限公司)檢測總蛋白濃度。將50 μg總蛋白使用10% SDS-PAGE膠進行分離后轉移至PVDF膜上，利用5% BSA溶液封閉后進行一抗孵育過夜，次日進行二抗孵育，經過壓片顯影后利用Image J軟件對圖片進行灰度分析。

2.4 正常組織與瘢痕疙瘩組織SOD、MDA和AOPP水平比較 見表4。瘢痕疙瘩組織中SOD、MDA和AOPP含量顯著高于正常組織(均P<0.05)。

2.2 三組患者瘢痕疙瘩組織不同部位SIRT1 mRNA和蛋白表達水平比較 見表2。在各組內，瘢痕疙瘩組織老化部、增生部SIRT1 mRNA和蛋白表達水平顯著高于浸潤部，且老化部高于增生部(均P<0.05)。三組間瘢痕疙瘩組織不同部位SIRT1 mRNA和蛋白表達水平比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

第五，充分發揮各級礦業協會的協調、支撐作用。礦業協會應提供理論指導、技術咨詢和第三方評估，加強對典型礦山的宣傳和先進企業的經驗推介，擴大在全社會范圍內的影響。依托綠色礦業發展指導中心、綠色礦業發展戰略聯盟等機構，適時召開現場交流培訓，整體提升礦業領域綠色治理能力。

2 結 果

面對這份要求和重擔，研究院黨委結合所面臨的工作環境，由班子成員帶隊深入各研究所與機關科室，開展了“訪基層、講形勢、聚人心、促工作”集中宣講，宣講形勢任務和上級政策要求，了解職工思想動態；編發了形勢任務教育宣傳材料，開展“跨越重大關口，決勝扭虧為盈”形勢任務教育；使大家充分認清形勢，明確研究院在分公司的定位，增強榮譽感，強化擔當意識，在全院干部員工心目中樹立和固化“公司增效責任在我，公司發展我來擔責”的責任心，鼓勵員工以不服輸、爭口氣的勁頭，把基礎研究工作做得更扎實、更細致、更務實，努力打好翻身仗。

2.3 正常組織與瘢痕疙瘩組織p65蛋白、p-p65蛋白及p-p65/p65水平比較 見表3。正常組織和瘢痕疙瘩組織p65蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。瘢痕疙瘩組織p-p65蛋白表達水平和p-p65/p65顯著高于正常組織(均P<0.05)。

表1 三組患者正常組織和瘢痕疙瘩組織SIRT1 mRNA和蛋白表達水平比較

表2 三組患者瘢痕疙瘩組織不同部位SIRT1 mRNA和蛋白表達水平比較

床邊教學是一種重要的醫學教學方式，是以臨床帶教教師為主導、學生為主體、病人為中心的臨床教學模式，一直以來都為世界各國醫學院所推崇，在二十世紀前半葉被廣泛應用于各醫學院校，到60年代約占75%的臨床培訓時間[2]。床邊教學已被描述成為一種理想的臨床教學模式，通過專業的病史詢問和體格檢查，在病人診治過程中提供一個全面的方法。但近年來，影像醫學和實驗室檢測技術的突飛猛進，使床邊教學時間明顯減少了，床邊教學目前約占醫學培訓的8%～19%[3]。在本科學習期間，若床邊教學這一重要內容減少，可能會導致部分年輕醫學生臨床技能下降。

表3 正常組織與瘢痕疙瘩組織p65蛋白、p-p65蛋白及p-p65/p65水平比較

1.2.3 SOD、MDA和AOPP含量檢測：將正常組織和瘢痕疙瘩組織經組織勻漿器勻漿后，離心以收集上清，分別采用SOD活性檢測試劑盒(批號：BC0170，上海吉至生化科技有限公司)、MDA含量檢測試劑盒(批號：BC0020，上海吉至生化科技有限公司)和AOPP ELISA試劑盒(批號：JM-04217H1，深圳市益百順科技有限公司)進行含量檢測。

瘢痕疙瘩是一種病理性瘢痕，以成纖維細胞過度增殖、膠原纖維異常沉積和炎癥為特征，表現出類似癌癥的特性，不會自發消退，切除后通常會復發。目前，臨床上對于瘢痕疙瘩有多種治療方法，但均被發現有療效低、不良反應大和復發風險高等特點，而造成瘢痕疙瘩無法被治愈的主要原因是其發病機制依然未被完全揭示[9]。Sirtuins是Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，通過對組蛋白和非組蛋白底物的去乙酰化發揮作用而參與衰老、表觀遺傳學、炎癥、癌癥和各種其他細胞過程[10]。Sirtuins蛋白家族共有7個蛋白，其中SIRT1是Sirtuins蛋白家族特征最明顯的蛋白，參與調節各類細胞活動，包括代謝、增殖、分化、壞死和凋亡，在糖尿病、慢性炎癥性肺部、神經退行性疾病、慢性腎病以及多種纖維化疾病的發生與發展中發揮重要作用[11-12]。而瘢痕疙瘩的特征是細胞外基質蛋白的過度產生和沉積，與傷口處成纖維細胞的持續存在有關，所以SIRT1被認為是治療瘢痕疙瘩的潛在靶點[8]。

表4 正常組織與瘢痕疙瘩組織SOD、MDA和AOPP水平比較

表5 瘢痕疙瘩組織SIRT1 mRNA和蛋白表達與SOD、MDA和AOPP的相關性

3 討 論

2.5 瘢痕疙瘩組織SIRT1 mRNA和蛋白表達與SOD、MDA和AOPP的相關性 見表5。在82例瘢痕疙瘩組織中，SIRT1 mRNA和蛋白表達水平與SOD、MDA和AOPP呈負相關(均P<0.05)。

2.1 三組患者正常組織和瘢痕疙瘩組織SIRT1 mRNA和蛋白表達水平比較 見表1。各組內，SIRT1 mRNA和蛋白在瘢痕疙瘩組織中的表達水平顯著低于正常組織(均P<0.05)。三組間SIRT1 mRNA和蛋白在正常組織和瘢痕疙瘩組織中的表達水平比較差異無統計學意義(均P>0.05)。

本研究通過qPCR和免疫印跡法分別檢測SIRT1 mRNA和蛋白在人瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織中的表達，結果發現SIRT1基因在人瘢痕疙瘩組織中的表達水平顯著高于正常皮膚組織，并且與瘢痕疙瘩病程無關，而與其在瘢痕疙瘩組織的表達部位有關。Bai等[8]研究發現，SIRT1在肥厚性瘢痕組織中的表達受到抑制，但與本研究不同，他們進一步探討了調節SIRT1對治療肥厚性瘢痕的可能性，而本研究則側重于研究SIRT1在人瘢痕疙瘩組織表達下調的臨床意義。進一步分析可知：第一，在皮膚的各種細胞類型中，成纖維細胞負責合成膠原蛋白和其他細胞外基質蛋白，并在傷口愈合和瘢痕形成中發揮關鍵作用[13-14]；第二，皮膚損傷后，成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞，其特點是表達α-平滑肌肌動蛋白，合成和分泌膠原蛋白的傾向增加，從而促進傷口愈合。然而，傷口愈合后成纖維細胞/肌成纖維細胞的持續存在可能導致瘢痕疙瘩的形成[13-14]；第三，研究表明上調SIRT1的表達可以抑制腎纖維化、肝纖維化和肺纖維化[15-17]，而SIRT1抑制劑則可以通過抑制5-氨基乙酰丙酸誘導的成纖維細胞的凋亡[7]。因此，在人瘢痕疙瘩組織表達降低的SIRT1可能與瘢痕疙瘩的形成有關。

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氧化應激指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態，傾向于氧化，導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物。近年來，多種氧化應激指標或氧化應激相關通路被發現在瘢痕疙瘩組織中表達異常，表明氧化應激參與了瘢痕疙瘩的形成[18]。基于此，本研究首先檢測氧化應激相關通路(核因子-κB信號通路)和氧化應激指標(SOD、MDA和AOPP)在人瘢痕疙瘩組織中的表達，結果發現人瘢痕疙瘩組織p-p65蛋白表達水平和p-p65/p65，以及SOD、MDA和AOPP含量均高于正常組織，這與之前的研究結果一致。重要的是，本研究還發現在82例瘢痕疙瘩組織中SIRT1 mRNA和蛋白表達與氧化應激指標(SOD、MDA和AOPP)均呈負相關。進一步分析可知：瘢痕疙瘩是發病率極高的纖維化疾病，瘢痕疙瘩組織中存在高水平的活性氧(氧化應激程度較高的標志)不僅可以促進一些重要的纖維化細胞因子的表達和分泌，而且參與調控成纖維細胞的增殖和凋亡[19]；而近年來研究[20]表明，SIRT1可以通過其去乙酰化作用在氧化應激狀態下調控多種靶蛋白的表達和修飾，包括p53、p65以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)等，以抵抗氧化應激，對細胞的增殖、分化、代謝和凋亡發揮調控作用。

綜上所述，SIRT1在人瘢痕疙瘩組織中表達降低，其表達水平與人瘢痕疙瘩病程無關，而與其在瘢痕疙瘩組織中的表達部位有關，并且可能通過抵抗氧化應激而參與瘢痕疙瘩的形成與發展。