響應面法優化蔗葉纖維素乙酸酯的制備工藝

周永升，張思原，龍勇益，蘇 龍，韋巧艷，蔡吉祥，唐 森，柳富杰*

(1廣西科技師范學院，廣西現代蔗糖業發展研究院，廣西來賓 546199；2廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧 530004)

0 引言

纖維素(Cellulose)是由β-D-葡萄糖基之間以β-1,4-糖苷鍵形成的鏈狀高分子，其分子鏈中每個葡萄糖單元上有3個活躍羥基，可以進行羥基的醚化反應、酯化反應及接枝共聚反應等[1]。由于纖維素具有可降解、無毒、無環境污染、來源廣泛等特點[2]，纖維素已廣泛應用于建筑[3]、造紙[4]、食品[5]、醫藥[6]等多個領域。纖維素廣泛存在于自然界中，植物纖維素的提取方法主要有堿處理法[7]、生物酶法[8]、蒸汽爆破法[9]、有機溶劑法[10]等?，F如今，纖維素改性主要集中在以下3種方法：①物理改性，如高能電子輻照處理[11]、溶劑交換[12]、微波[13]和超聲波[14]處理等；②化學改性，如酯化反應[15]、醚化反應[16]、接枝共聚反應[17]等；③生物改性，包括酶的水解[18]、微生物降解氧化[19]等。

近年來，甘蔗葉資源浪費已經成為我國較大的環境問題，甘蔗葉是制糖工業過程中的廢棄物，是一種可再生生物質資源，甘蔗葉中含有50%左右的纖維素[20]。但是國內對甘蔗葉的利用不合理，在采集甘蔗時直接對甘蔗葉進行丟棄或者就地焚燒，大大浪費了資源且污染環境[21]。因此，為了合理利用廢棄物資源，可以從甘蔗葉中提取出優質的纖維素并進行高附加值的加工生產，將很大程度上拓寬甘蔗葉的綜合利用渠道。

本研究是利用堿處理手段提取蔗葉纖維素，并且對蔗葉纖維素進行乙?；男?，制備出取代度較高的蔗葉纖維素乙酸酯(Sugarcane Leaf Cellulose Acetate，SLCA)。纖維素乙酸酯(Cellulose Acetate，CA)是一種食品、化工的重要原輔材料，本研究主要以蔗葉纖維素為原料，考慮?；瘎┡c蔗葉纖維素的液料比、?；瘎┑慕M成比例、濃硫酸用量、反應溫度、反應時間作為考察因素，探索它們與酯化取代度(Degree of Substitution，DS)的關系，再通過響應面設計試驗優化蔗葉纖維素乙?；男缘臈l件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗葉是甘蔗梢和種植期間剝離的混合樣品。酶制劑：熱穩定α-淀粉酶(酶活≥3.5 U/mg，上海穎心實驗室設備有限公司)；堿性蛋白酶(酶活≥200 U/mg，合肥博美生物科技有限責任公司)；脂肪酶(酶活≥30 U/mg，上海源葉生物有限公司)。其他試劑均為分析純。儀器設備：FW177型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；FA2004型分析天平(上海越平科學儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環水多用真空泵(鞏義市科瑞儀器有限公司)；DZF6050型真空干燥箱(上海識捷實業有限公司)；GZX-GF101-3 BS型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫療器械有限公司)；HH-S8型恒溫水浴鍋(金壇市醫療儀器廠)；H1850型臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 蔗葉的預處理

⑴粉碎過篩：將清洗過的甘蔗葉在65℃±5℃下烘干，然后剪切成小段，用粉碎機粉碎后過40目篩密封保存。

⑵參考林杰[22]等人的方法去除蛋白質、淀粉和脂肪：用相對于蔗葉粉末質量分數0.3%混合酶(蛋白酶和α-淀粉酶質量比為1∶3)溶液浸泡蔗葉粉末，其中液料比為20∶1，在65℃下酶解90 min，過濾，再將酶解后的濾渣用蒸餾水洗凈。將濾渣用液料比為20∶1的脂肪酶溶液進行酶解，脂肪酶用量為0.4%、溫度為50℃、酶解時間為60 min，之后使用100℃水浴滅酶10 min，再用蒸餾水將濾渣洗至中性，放入65℃±5℃烘干，粉碎過40目篩備用。

⑶參考李春光[23]、Gil-López[24]、Ann[25]等人的方法去除木質素和半纖維素：稱取上述粉末，按液料比30∶1加入體積分數0.7%的H2O2和質量分數4%的NaOH混合溶液，在85℃下攪拌4 h，濾渣用蒸餾水洗凈，65℃±5℃干燥后粉碎過40目篩。然后取堿液處理后的粉末，按液料比30∶1加入31 mL/L乙酸和9.5 g/L NaClO2混合溶液，在75℃下處理1 h，過濾后用蒸餾水洗滌至中性，65℃±5℃烘干后粉碎過100目篩備用。纖維素含量的測定按照李春光[23]的方法平行測定3次。

1.2.2 乙酰化蔗葉纖維素的制備

將2 g蔗葉纖維素和一定體積的乙酸酐-冰乙酸混合溶液加入到圓底燒瓶中，并且加入一定量的濃硫酸作為反應催化劑。在一定溫度下，于回流冷凝裝置中反應一段時間，反應結束后，將圓底燒瓶取出，冷卻至室溫后加入50 mL的無水乙醇沉淀1 h，抽濾，用蒸餾水沖洗濾渣至中性，除去沒有反應完全的乙酸。最后將濾渣在30℃下真空干燥至恒重，測定DS值。按照傅七蘭[26]的醇皂法平行測定3次。

1.2.3 制備乙酰化蔗葉纖維素的單因素試驗設計

按照1.2.2節的制備步驟進行?？紤]液料比(15∶1，20∶1，25 1∶，30∶1，35 1∶)、相對于冰乙酸的乙酸酐體積分數(40%、45%、50%、55%、60%)、相對于乙酸酐-冰乙酸混合溶液的濃硫酸體積分數(0、0.25%、0.5%、0.75%、1%)、酯化溫度(80、85、90、95、100℃)、酯化時間(1.5、2、2.5、3、3.5 h)等因素和水平。固定相對于冰乙酸的乙酸酐體積分數為50%、相對于乙酸酐-冰乙酸混合溶液的濃硫酸體積分數為0.5%、酯化溫度為90℃、酯化時間為2.5 h，以DS為指標，進行單因素試驗得到最佳液料比，再依次確定其他因素的水平。最后進行單因素方差分析結果，篩選合適的3個因素進行制備工藝的優化。

1.2.4 Box-Behnken響應面試驗設計及驗證實驗

根據單因素試驗結果，以DS為指標進行3因素3水平Box-Behnken響應面試驗，試驗設計見表1。確定最佳制備工藝，并建立數學模型，分析因素間的相互作用。通過規劃求解后得到工藝條件的理論值，重復5次實驗，并進行t檢驗，檢查工藝的穩定性、模型的準確性。

表1 Box-Behnken響應面試驗設計表

1.3 數據處理

通過Excel 2016進行數據統計、標準偏差計算及表格制作，使用Minitab 18進行Tukey多重比較分析(α=0.05)，運用Excel 2016和Origin 2018繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素結果

2.1.1 液料比

蔗葉經過預處理后得到了纖維素含量為92.56%的樣品。使用該樣品進行乙?；男裕芯苛弦罕葘S的影響，結果見圖1。液料比在15～35 mL/g范圍內，DS呈先上升后下降的趨勢，但是不具有統計學差異(P＞0.05)。液料比過低時底物較少，乙酰化效果不好，隨著液料比的升高，酯化反應向正方向進行，DS也在上升，在液料比達到25 mL/g時，DS為2.248。但當液料比超過25 mL/g時，DS反而減小。原因可能有2方面：一是過量的乙?；噭┮种屏朔磻倪M行，二是過量的乙酸酐使得反應體系呈較強的酸性，導致生成的纖維素乙酸酯發生分解[27]。綜上，確定最佳液料比為25 mL/g。 2.1.2 乙酸酐體積分數

圖1 料液比對DS的影響

試驗考察了乙酸酐體積分數(相對于冰乙酸40%～60%)對DS的影響，由圖2可知，DS先顯著上升后(P＜0.05)再略微下降，即當乙酸酐體積分數大于45%之后，DS差異不顯著(P＞0.05)。DS隨著乙酸酐體積分數的增加逐漸上升，在乙酸酐體積分數為50%時DS達到最大，DS等于2.250。因為當乙酸酐體積分數增加時，酯化反應平衡向正方向移動；同時，隨著酯化反應的進行，酯化反應生成的水會參與水解反應，促進酯化反應，有利于提高DS[28]。當乙酸酐體積分數繼續增大時，會導致DS逐漸下降。因為酯化反應是可逆的，而且酸對纖維素有一定的降解作用，所以DS低于理論值3.0[28]。綜上，確定最佳乙酸酐體積分數為50%。

圖2 乙酸酐體積分數對DS的影響

2.1.3 濃硫酸體積分數

試驗考察了濃硫酸體積分數(相對于乙酸酐-冰乙酸混合溶液0～1%)對DS的影響，由圖3可知，DS先顯著上升后再顯著下降(P＜0.05)，當濃硫酸體積分數為0.50%時DS達到最大，DS等于2.231。因為纖維素的乙?；磻枰跓o水體系中進行，使用濃硫酸作催化劑可以減少反應體系中的水，從而減少產物水解；當濃硫酸用量過大時，纖維素發生氧化降解，且在乙?；^程中會生成少量的纖維素硫酸酯、纖維素磺醋酸混合酯、乙酰硫酸等[26,28]。綜上，確定最佳濃硫酸體積分數為0.50%。

圖3 催化劑用量對DS的影響

2.1.4 酯化溫度

試驗考察了酯化溫度(80～100℃)對DS的影響，由圖4可知，DS先顯著上升后(P＜0.05)再略微下降。DS隨著酯化溫度的增加逐漸上升，在酯化溫度為95℃時DS達到最大，DS為2.252。因為溫度較低時，酯化反應不完全導致DS不高；當溫度過高時，少量的纖維素在高溫酸環境中會發生脫水、氧化、縮水等副反應，造成DS降低[26]。綜上，確定最佳酯化溫度為95℃。

圖4 反應溫度對DS的影響

2.1.5 酯化時間

試驗考察了酯化時間(1.5～3.5 h)對DS的影響，由圖5可知，DS先顯著上升后再顯著下降(P＜0.05)，當酯化時間為2.5 h時DS達到最大，DS等于2.246。因為在酸的作用下，隨著時間的延長，纖維素分子原有結構受到破壞，羥基不斷暴露出來，DS增加；而作用時間過長導致纖維素在酸性環境中發生輕度降解導致DS略微減小。綜合考慮，確定反應時間以2.5 h為宜。

2.1.6 單因素方差分析

各因素的方差分析見表2，由表可知，各因素對DS的影響顯著性程度依次是：酯化溫度、濃硫酸體積分數、酯化時間、乙酸酐體積分數、液料比。選取影響較顯著的3個因素進行響應面試驗，優化酯化工藝。

表2 各因素方差分析表

2.2 Box-Behnken響應面試驗結果及驗證

2.2.1 響應面試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，以酯化溫度、濃硫酸體積分數、酯化時間為考察因素，以DS為指標，設計Box-Behnken響應面試驗，實驗結果見表3。利用Design-Expert軟件對試驗數據進行分析，可以得到DS的多項式回歸方程(自然變量)。方程為：

表3 響應面試驗結果

對回歸方程進行方差分析，結果見表4。F值可用于測試每個變量對響應值的意義。F越大，則相應變量的顯著程度越高。當顯著性檢驗P＜0.05時，說明其具有統計學意義。從表4可以得出結論，模型P＜0.0001，該模型已達極顯著水平；失擬項P=0.5276＞0.05(不顯著)，決定系數R2=0.9883，說明具有較高的顯著性，而R2adj=0.9732，能夠解釋實驗 97.32%的響應值變化，且預測相關系數R2Pred=0.9150，C.V.%=3.36，說明此實驗模型與真實數據擬合程度良好，擬合度較高，可用于分析和預測蔗葉纖維素乙酸酯的制備效果?；貧w方程系數的顯著性分析：A、B、C、A2、B2、C2對DS的影響達到極顯著水平，AC達顯著水平。A、B、C 3個因素對DS影響大小順序為：A＞C＞B，即反應溫度＞催化劑用量＞反應時間。

表4 方差分析結果

圖6是根據上述回歸方程繪出的各因素交互作用對DS影響的等高線圖和響應曲面圖。等高線越接近橢圓表明兩因素交互作用越強，且等高線越密集則影響效果越大；響應曲面圖呈凸面，直觀地反映了這些因素對DS的影響。在所研究的區域內均存在一個極值點，隨著各因素從小到大變化，DS呈現先增后減(或先增后緩)的趨勢，這與單因素實驗結果相一致。其中，結合表4可知，交互項AC的P值為0.0392，表明反應溫度和催化劑用量之間的交互影響達到顯著水平。

圖6 各因素交互作用對DS影響的等高線及響應面圖

2.2.2 最佳條件的確定及驗證

通過對試驗數據的處理與分析，得到最佳條件為：反應溫度97℃、反應時間2.4 h、催化劑用量0.57%，此時模型理論結果為DS=2.600。進行5次重復實驗，DS分別為2.484、2.591、2.561、2.624、2.555，DS平均值2.563與模型預測結果接近。通過t檢驗分析(α=0.05)，經過雙尾檢驗可知重復實驗值和預測值沒有顯著差異，再經過單尾檢驗可知重復實驗的DS沒有顯著減小，表明所建回歸模型具有良好的預測效果。

3 結論

本實驗以蔗葉纖維素為原料進行乙?；磻?，制備蔗葉纖維素乙酸酯。通過單因素試驗和響應面試驗結果可知，蔗葉纖維素乙酸酯最佳制備條件為液料比25 mL/g、乙酸酐體積分數50%、反應溫度97℃、反應時間2.4 h、催化劑用量0.57%，此時蔗葉纖維素乙酸酯DS為2.600。建立的數學模型與真實數據擬合度較高，可用于分析和預測蔗葉纖維素乙酸酯的制備效果。研究成果為蔗葉纖維素乙酸酯的制備及應用提供了參考依據。