葛仙米血紅素氧合酶基因Ns-HO1異源表達及其蛋白結構模擬

黃 卉 陳 莉 汪海洋 方 慶 程 超

(1. 湖北民族大學，恩施 445000; 2. 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，恩施 445000)

在生物細胞中, 氧、有機碳環和金屬離子三者共同作用能夠形成一些特殊的化合物, 并在生命活動中發揮重要的功能。血紅素(Heme)是一類含鐵原卟啉[Ferro-protoporphyrin (Fe2+)]化合物,在生物組織細胞中廣泛分布。據緊鄰其四吡咯環外圍的基團, 血紅素可分為a、 b和c三種不同類型[1]。其中, 在動物細胞中c型血紅素以卟啉外圍基團共價結合血紅蛋白, 對于氧的轉運和貯存、細胞能量產生和解毒等具有重要功能; 另一方面, 細胞內游離的血紅素卻可誘發活性氧進而造成細胞氧化應激損傷[2—4]。因此, 細胞內血紅素須受酶促作用調節以維持相對穩定; 而研究血紅素及其酶促調節與人體健康和疾病間的關系具有重要意義[4—6]。

血紅素氧合酶(Heme oxygenase, HO, 也稱血紅素氧化酶)能夠結合并氧化血紅素, 使之轉變為膽綠素(Biliverdin, BV), 并釋放亞鐵離子(Fe2+)和一氧化碳(CO); 該酶是細胞中目前發現的血紅素氧化分解的限速酶[7,8]。最初, 人們發現動物體肝臟微粒體中一種介導血紅素氧化分解的酶活性較高;2002年, 日本研究人員報道了首個因人類血紅素氧合酶基因功能缺失、危害兒童生長發育乃至生命的病理案例, 證實血紅素氧合酶HO是抵抗炎癥、預防內部組織進一步氧化損傷刺激的重要防御性因子; 隨后, 關于生物體中血紅素氧合酶HO的結構與功能方面的研究等取得了較多進展[9—11]。目前,在植物等其他生物類群中也發現HO酶的同源基因,這些基因參與植物抵抗外部環境脅迫、種子萌發、氣孔開閉及根形態發生等多方面的調節[7,12,13]。

原核生物中一些厭氧菌利用血紅素氧合酶來清除多余的氧分[14]。葛仙米(Nostoc sphaeroides),學名擬球狀念珠藻, 作為藍藻綱特殊的原核藻類在湖北恩施地區分布較多, 具有重要的食藥性價值;新近研究發現葛仙米是促進水稻作物生產的重要資源藻類[15—18]。伴隨經濟社會發展, 亟需深入研究和開發葛仙米的生物資源。本研究借助分子生物學等研究方法, 克隆葛仙米血紅素氧合酶基因并進行大腸桿菌細胞誘導表達, 對其蛋白進化地位和高級結構進行比較分析。本研究有利于深入了解葛仙米血紅素氧合酶基因生物學功能, 并為進一步加強葛仙米資源運用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

葛仙米采自湖北恩施鶴峰走馬鎮(東經118.4°,北緯29.8°)。分子克隆用工具酶、表達載體等分別購于大連寶生物公司(TaKaRa)等公司; PCR用引物由南京金斯瑞公司合成; 克隆與表達大腸桿菌菌株等材料為實驗室保存。

1.2 DNA的提取

采用CTAB法提取葛仙米總DNA。取少量樣品(2—3團, 約1 mg)置于預冷的研缽中, 加入CTAB抽提緩沖液, 浸潤后迅速研磨成糊狀, 然后轉入EP管中, 于65℃保溫; 30min后取出, 冷卻后離心,將上清移入新的EP管中, 再加氯仿-異戊醇(24∶1),顛倒混勻, 10000 r/min離心10min, 輕輕吸取上清,加入600 μL異丙醇, 輕輕混勻(可見絮狀物), 4℃靜置10min后, 12000 r/min 離心10min; 75%乙醇洗滌沉淀并晾干, 溶解并低溫貯存樣品。

1.3 PCR擴增

據GenBank 中HO1基 因(AP018326)采用BLAST檢索葛仙米對應基因組 (Locus, NZ_CP031941) 中同源序列, 分析目的基因序列(區段為53825525383229),設計上、下游引物分別為: 5′-GGCATATGAGTAGTAA TCTAGCCAT-3′; 5′-GAATTCCTAATGAGTTAG GCTATTA-3′; 上下游引物分別設計限制性核酸內切酶位點為NdeⅠ和EcoRⅠ(堿基序列下劃線所示).擴增目的基因的PCR反應程序為 95℃ 3min, 95℃30s, 50℃ 30s, 72℃ 45s, 72℃ 5min, 16℃ 10min, 反應循環數設為30。

1.4 克隆目的基因

上述擴增產物進行乙醇沉淀回收。連接反應體系為DNA 1.0 μL, ddH2O 3.5 μL, pMD18-T 0.5 μL,Solution 5.0 μL。16℃連接10h, 取連接產物2 μL進行熱激轉化法轉化大腸桿菌感受態細胞, 挑選中間克隆子并提取質粒和測序鑒定。

1.5 表達載體連接與轉化

pCold Ⅰ 載體及中間載體進行酶切反應體系為: 載體 3.0 μL,NdeⅠ 1.0 μL,EcoRⅠ 1.0 μL, 10×H buffer 5.0 μL, ddH2O (含RNase) 40 μL。將上述成分輕輕混勻后, 37℃保溫4h, 回收酶切表達載體及目的基因片段, 進行連接反應后轉化感受態細胞,再挑選克隆子進行測序等進一步鑒定。

1.6 序列與蛋白結構分析

對目的基因HO1編碼蛋白氨基酸序列, 限定Nostoc種屬進行序列比對, 包括NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST和Clustal (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw);采用MEGA分子進化軟件構建目的蛋白基于Neighbor-Joining 方法的系統進化樹, Bootstrap參數設為1000; 葛仙米Ns-HO1蛋白結構分析采用Swiss-model(https://www.swissmodel.expasy.org/), 基于氨基酸序列相似性確定參比模板, 而后進行分子模擬。

1.7 目的蛋白大腸桿菌誘導表達與檢測

將正確的重組質粒導入表達菌株 BL21感受態細胞中, 0.1 mmol/L IPTG 誘導表達 4h, 超聲破碎細胞(破碎功率為 66 W, 時間 10s, 重復 3次, 間隔10s),制備表達樣品后進行 SDS-PAGE凝膠電泳分析。

2 結果

2.1 目的基因Ns-HO1擴增

提取葛仙米基因組DNA, 并以其為模板進行PCR。 1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。結果如圖 1A所示, 目的基因泳道(泳道1)出現擴增單一DNA條帶; 參照DNA標準分子量 (泳道M), 擴增DNA大小在500—750 bp, 與預期較符合。將目的基因片段回收并成功與pMD18-T克隆載體連接送出測序。結果顯示目的基因密碼區全長為678 bp。以上表明, 葛仙米血紅素氧合酶基因Ns-HO1克隆成功。

2.2 Ns-HO1基因在大腸桿菌中表達

為進一步研究目的基因Ns-HO1, 我們成功構建了原核細胞表達載體pCold-Ns-HO1. 對轉入重組表達載體的大腸桿菌經約4h, 0.1 mmol/L IPTG誘導。而后進行超聲細胞破碎處理, SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況。結果顯示, 表達樣品在上清和沉淀(電泳泳道3和4; 圖 1B)中均有近26.0 kD的蛋白分子聚集, 而對照樣品中均未見明顯蛋白聚集(電泳泳道1和2), 表明試驗條件下葛仙米血紅素氧合酶基因Ns-HO1能夠在大腸桿菌細胞中順利表達。

2.3 目的基因HO1分子進化

葛仙米屬藍藻門念珠藻科, 其生態型與生境具有特殊性[18,19,21]。葛仙米Ns-HO1預編碼含225個氨基酸的多肽鏈。在人類血紅素氧合酶與一種腦膜炎病菌HO1分子中, 最近的螺旋(近N端α螺旋)中一個氨基酸位點(His-25/23)突變能夠導致酶失活,被認為是底物血紅素與HO1的最直接接合位點[9]。序列分析顯示, 在念珠藻HO1分子中, His17(H17)與該His-25/23位點對應, 可能是血紅素金屬鐵離子的關鍵接合位點(圖 1C, 黑色倒三角所示); 其他關鍵位點如底物血紅素的預結合位點(如Arg10, Tyr125)在該蛋白氨基酸序列中保持穩定(圖 1C, 黑色菱形所示氨基酸位點)。

選取念珠藻科里的典型種質, 如點狀念珠藻(Nostoc punctiforme), 發狀念珠藻(Nostoc flagelliforme)和普通念珠藻(Nostoc commune)等, 對其血紅素氧合酶基因編碼蛋白的氨基酸序列進行綜合比對分析, 并構建分子進化樹(圖 1C和圖 2)。結果顯示, 血紅素氧合酶同源蛋白氨基酸序列總相似性可達90.3%。血紅素氧合酶特異性分割血紅素分子α-碳鍵, 產生膽綠素IXα, 酶與底物首先接合是反應順利進行的前提條件。這些氨基酸位點替換, 可能在一定程度上影響同源蛋白的活性, 預示不同種源念珠藻的血紅素氧合酶功能可能存在變異。分子進化樹顯示, 葛仙米Ns-HO1與點狀念珠藻 (Nostoc punctiforme)等幾個分支藻種中的血紅素氧合酶親緣關系較近 (圖 2)。該結果也為葛仙米區分與其生態型相近的念珠藻種提供了證據[18,21]。

圖1 目的基因Ns-HO1PCR擴增(A)及其表達蛋白(B)與氨基酸序列分析(C)Fig. 1 The gene Ns-HO1 amplication by PCR (A), and its protein(B) and the amino acid sequence analysis (C)

圖2 念珠藻中HO1系統進化樹Fig. 2 The phylogenic tree of HO1 from Nostoc sp.

2.4 Ns-HO1蛋白高級結構模擬

在葛仙米Ns-HO1形成的二級結構中, 以8個α-螺旋為主要類型。其中位于N和C末端的兩個螺旋(α-螺旋H1和H8) 較大, 并與第四螺旋共同形成Ns-HO1分子的支撐底面; 并且C末端的螺旋, 其突出部分可視為HO1單分子結構的一個特殊支撐; 而另外幾個α-螺旋進一步延展并填充其中。含有血紅素預結合位點氨基酸殘基(圖 1C, 黑色菱形所示)的幾個肽段形成的螺旋(包括第一、五和七螺旋結構)分布于Ns-HO1分子的外圍(圖 3A), 為底物捕獲提供了便利; 另外, 我們發現在念珠藻血紅素氧合酶HO1中, 一段非常保守的甘氨酸序列(-G-D-L-S-GG-) (圖 1C, 方框所示), 構成為第五和第六α螺旋向上延展的連接點, 從而為形成Ns-HO1分子高級結構提供了條件[9,20]。當細胞內游離的血紅素分子與HO1靠近后, HO1分子以第一、三和五等主要螺旋維持的疏水內核空間, 利于血紅素進一步在HO1分子內深入進而發生反應(圖 3B)。

圖3 Ns-HO1 分子結構模型與血紅素進入HO1 分子模式Fig. 3 Ns-HO1 molecular modeling

3 討論

細胞內活性氧等自由基能夠損害脂質、蛋白質、DNA等生物大分子并抑制其正常功能, 自由基理論強化了營養與健康和疾病之間聯系[22—24]。適當補充天然抗氧化物, 對于保持健康、預防疾病產生具有重要作用[24]。葛仙米在我國食用歷史悠久,含有豐富的蛋白質、多糖、脂類與維生素等活性物質; 另外, 葛仙米可能還具有抑制感染、抵抗氧化、減緩衰老和預防腫瘤等重要活性[15—17]。在藍藻中, 血紅素氧合酶參與藻膽素的合成; 而藻膽素是藍藻構建藻膽體光合器的必需色素, 可能在醫用生物素方面具有重要的開發價值[17,19,25]。本研究首次克隆了葛仙米的血紅素氧合酶基因Ns-HO1,進行IPTG誘導表達, 經SDS-PAGE鑒定成功表達目的蛋白, 并對Ns-HO1分子進化和高級結構進行分析。實驗為進一步研究血紅素氧合酶基因Ns-HO1的生物學功能、探討其作用機制, 及進一步運用奠定了基礎。

在有氧細胞中, 血紅素合成與分解代謝處于動態平衡。HO作為血紅素降解的起始酶和限速酶,能氧化分解血紅素產生膽綠素(Biliverdin, BV)、亞鐵離子和一氧化碳。目前, 念珠藻科來源的HO1同源基因編碼血紅素氧合酶的活性研究較少。比較而言, 該酶蛋白分子中關鍵位點尤為保守, 如His17位點和保守的甘氨酸模體等(圖 1C), 這為底物血紅素中金屬亞鐵離子與該酶分子接合提供了位點基礎。而葛仙米血紅素氧合酶分子形成以8個α-螺旋二級結構為主要支撐的類夾心式結構(圖 3A),為氧化分解血紅素并成功釋放產物提供了重要空間條件[9]。葛仙米血紅素氧合酶其保守的C末端螺旋一部分突出于夾心結構表面, 可能為該酶分子活性提供支撐; 亦或有可能作用于其他分子。另外,血紅素氧合酶HO1的分子進化亦可為葛仙米區別于其他近源念珠藻種提供證據[18,21]。

膽紅素是一種內源性很強的抗氧化劑, 具有抗氧化、抗脂質過氧化作用; 亞鐵離子是一種在體內具有多種生物活性的金屬, 它可以被機體產生的細胞內儲存鐵蛋白迅速結合, 從而失去催化自由基產生和防止其介導的氧化應激損傷的功能; 一氧化碳作為一種氣體信號分子, 可以通過cGMP途徑發揮其生理功能[7,26,27]。這表明血紅素氧合酶的防御或應激活性很可能與其酶促產物緊密關聯。我們借助模式動物飼喂等實驗, 發現該蛋白很可能具有增強機體應激的功能(本文未顯示結果), 但其具體作用機制還有待深入研究。已有研究發現, 真核來源的血紅素氧合酶HO1能夠保護細胞免受血紅素介導的氧化和亞硝基應激和損傷, 并能夠在多種病理條件下參與髓系細胞的募集和T細胞的反應[28,29]。在HIV-1感染時, 多個免疫細胞亞群中HO1基因表達上調;HO1過表達調控抗HIV免疫; 在惡性腫瘤胰腺管癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PADA)細胞中, 低氧條件下抑制HO1表達, 則能夠抑制PADA細胞增殖, 并強化藥物治療效果[30,31]。可見,若主動調節血紅素氧合酶在人體的活性, 有利于保障健康、預防和治療疾病。總之, 本研究為深入了解葛仙米血紅素氧合酶基因Ns-HO1功能并為其進一步運用提供了分子基礎。