甘藍型油菜BnNF-YA1的克隆和功能鑒定

林科運 段鈺晶 王高升 孫念禮 方玉潔 王幼平

（揚州大學生物科學與技術學院，揚州 2250009）

甘藍型油菜（Brassica napus L.）屬于十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）［1］，其不同部位具有不同的經濟價值：油菜籽的出油率高，可作為食用油；油菜本身也含有大量蛋白質，是動物飼料重要來源；除此之外，發達國家也會利用油菜制成生物柴油來取代部分化石燃料［2-5］。我國油菜的種植面積和總產量均居世界前列，然而我國人口眾多，對菜籽油的需求量日趨增大，導致我國菜籽油每年的進口量不斷上升［6］。近年來，全球生態環境持續惡化，自然災害頻發，包括干旱、高鹽、極端溫度等在內的環境脅迫對油菜的生長發育和產量造成了嚴重威脅［7］，使得我國食用油供求不平衡的狀況日益嚴峻。因此，挖掘油菜逆境應答相關遺傳資源、提高油菜抗逆性對于油菜生產具有重要意義。

為更好地適應不利的環境條件并得以生存，植物在進化歷程中形成了一套完整且復雜的逆境應答機制，植物在響應非生物脅迫的過程中涉及多個層面的基因表達調控，包括激素調節、轉錄水平調節以及轉錄后水平調節逆境相關基因等［8-10］。前人研究表明，MYB、AP2/ERF、bZIP、Zinc finger、NAC、WRKY、NF-Y等轉錄因子家族在植物逆境應答調控中發揮著重要作用［11］。植物核因子Y（nuclear factor Y，NF-Y）類轉錄因子是一類結構保守的三聚體復合物，由NF-YA、NF-YB和NF-YC三亞基組成，對CCAAT-box元件具有高度特異性和高度親和力［12-13］。NF-YA的核心保守區域包含大約56個氨基酸［14］，可分成2個結構域以及中間的連接區，其中一個A1結構域是由20個氨基酸形成的α螺旋，位于蛋白N端，是與NF-YB/NF-YC互作所必需的；另一個A2結構域位于蛋白C端，是由21個氨基酸組成的α螺旋，可以特異性結合啟動子序列上的CCAAT-box［15］。NF-YB 亞基存在與 H2A 結構域極相似的組蛋白折疊模體（histone fold motif，HFM），該區域由3個α螺旋和2個β鏈組成，以α1-β1-α2-β2-α3排列順序組成，α1主要負責與 CCAAT附近的DNA骨架結合，α2、α3區域與NF-YC結合形成二聚體，NF-YC的結構特征與NF-YB相似［16］。NF-Y復合體在行使功能時，NF-YB亞基和NF-YC亞基通過組蛋白折疊結構域（histone folding domain，HFD），采用從頭到尾的組裝方式［17］，在細胞質中先形成異源二聚體，隨后遷移到細胞核中與NF-YA亞基結合形成完整的異源三聚體，A2結構域將利用A1和A2之間的連接螺旋在DNA上滑動，尋找CCAAT-box序列，隨后NF-YA插入到DNA雙螺旋的小溝中，DNA發生彎曲，使得其他轉錄因子更容易結合到DNA雙螺旋的大溝，進而調控下游的靶基因［18-20］。NF-YA、NF-YB和NF-YC亞基自身也可以單獨行使特定的功能［21］。

近年來，NF-YA在各種植物中的功能逐漸被挖掘，研究發現，NF-YA轉錄因子廣泛參與了植物對各種生物與非生物脅迫應答以及植物的生長發育過程。擬南芥NF-YA5受干旱脅迫強烈誘導，過表達AtNF-YA5使轉基因擬南芥葉片的氣孔孔徑變小、失水速率降低，同時激活脅迫響應基因的表達，增加了擬南芥的抗旱性［22］。水稻OsNF-YA7受干旱脅迫誘導表達，而不受脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導表達，過表達OsNF-YA7能夠提高轉基因植株的耐旱性，說明OsNF-YA7通過不依賴ABA的方式介導水稻的耐旱性調控［23］。棉花GhNF-YA10和GhNF-YA23受鹽脅迫、干旱脅迫和ABA處理誘導表達，在棉花中利用VIGS技術對GhNF-YA10和GhNF-YA23進行沉默導致棉花幼苗在鹽脅迫條件下萎黃、耐鹽性顯著性降低［24］。大豆GmNF-YA3受ABA、PEG、NaCl和冷脅迫誘導表達，過表達GmNF-YA3的轉基因擬南芥耐旱性增強，而對鹽脅迫和ABA處理的敏感性增強［25］。GmNF-YA5在大豆的21個NF-YA基因中轉錄水平最高，過表達GmNF-YA5的轉基因大豆耐旱性增強，且轉基因植株中ABA依賴型和ABA非依賴型基因表達水平升高，暗示著其能通過依賴和不依賴ABA的途徑介導大豆耐旱性調控［26］。研究者從耐鹽小麥品種SR3中鑒定到TaNF-YA10-1，組成型表達TaNF-YA10-1的擬南芥植株對鹽脅迫的敏感性提高，而耐旱性增強，說明其在應答干旱和鹽脅迫中的功能是相對獨立的［27］。Lian等［28］將毛果楊 PtNF-YA9在擬南芥中過表達獲得OxPtNA9材料，OxPtNA9株系在萌發階段對模擬干旱、ABA和鹽脅迫表現出敏感性，萌發后生長停滯，而在苗期則通過促進氣孔關閉、提高水分利用效率、減少失水表現出對干旱的耐受性增強；與對照相比，OxPtNA9系在含有NaCl的1/2 MS培養基中表現出較長的初生根，在土培條件下也表現出更強的耐鹽性，說明PtNF-YA9采取一種馴化策略來應對不利的環境條件。甜橙CsNF-YA5在葉片和根系中對缺水的應答表現出差異，在煙草中過表達CsNF-YA5能夠使轉基因植株在脫水條件下減少H2O2的產生，并在正常和干旱脅迫條件下提高植株的生長和光合速率，這些生理生化反應有助于甜橙應對短期土壤缺水的環境［29］。除了調控植物對脅迫環境的應答，NF-YA還被報道參與調控植物的根系發育［30］、開花［31］、胚胎和種子發育等多種生物學過程［32-33］。

NF-YA生物學功能的多樣性引起了學者們廣泛的關注，目前，研究者們已陸續在大豆、擬南芥、小麥、馬鈴薯、玉米等植物中鑒定出許多NF-YA家族成員［34-37］。前人對甘藍型油菜中NF-Y家族成員進行了初步鑒定和表達分析［38-39］，但油菜中關于NF-YA的功能研究尚不深入。

本研究通過克隆BnNF-YA1的編碼序列，對其序列特征和表達特性進行分析，獲得過表達BnNFYA1的甘藍型油菜植株，并對其進行逆境脅迫表型鑒定，為深入研究BnNF-YA1在甘藍型油菜逆境應答中的調控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍型油菜轉化受體材料為甲9712（J9712），由華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室周永明教授惠贈。利用已測序甘藍型油菜Darmor-bzh的cDNA樣品作為基因片段擴增的模板。Darmorbzh及用于瞬時表達分析的本氏煙草（Nicotiana benthamiana L.）種子由揚州大學生物科學與技術學院油菜生物學實驗室保存。

大腸桿菌感受態Trans-T1購自北京全式金生物技術有限公司。Phanta Max Super-Fideity DNA Polymerase、RNA isolater Total RNA Extraction Reagent、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、重組克隆試劑盒購自南京諾維贊生物科技有限公司。逆轉錄試劑盒、限制性內切酶購自New England Biolabs公司。引物合成及DNA測序委托南京擎科生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 BnNF-YA1的生物信息學分析 通過Protpraram（https://web.expasy.org/protparam/）對 BnNF-YA1蛋白進行理化性質分析；利用Expasy（https://web.expasy.org/protscale/）進行親/疏水性分析；利用Expasy的TMHMM在 線 軟 件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行跨膜結構域分析；利用軟件 Netphos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進行蛋白磷酸化位點分析。分別利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和在線網站SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive#sequence）進行二級結構和三級結構預測；通過在線網站CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行保守結構域分析；利用SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽預測。利用在線網站SWISS-MODEL進行三級結構預測。利用DNAMAN對BnNF-YA1及其同源蛋白序列進行多序列比對分析；利用MEGAX64對BnNF-YA1及其同源蛋白進行系統發生分析［40］。

1.2.2 BnNF-YA1的克隆 利用油菜公共數據庫Brassica napus Genome Browser（http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/cgi-bin/gbrowse/colza/）獲取候選基因的序列信息。使用軟件Primer Premier 5.0設計特異性引物（BnNF-YA1-F：5′-GCTTCACGGCTCTTCTAA-3′，BnNF-YA1-R ：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′），委托南京擎科生物科技有限公司合成引物，擴增BnNF-YA1編碼序列。

1.2.3 BnNF-YA1的表達分析 為了了解BnNF-YA1逆境表達模式，對4葉期的甘藍型油菜幼苗進行不同逆境條件處理。干旱處理：15% PEG模擬干旱，分別在處理前、葉片輕度、中度、重度萎蔫時取樣；冷處理：4℃處理，分別在處理0、3、6 和12 h取樣；熱處理：42℃處理，分別在處理0、0.25、0.5和1 h取樣；ABA處理：噴施0.6 μmol/L ABA，分別在處理0、0.5、1和3 h取樣，檢測BnNF-YA1的表達量。為了獲得BnNF-YA1的時空表達模式，檢測BnNF-YA1在子葉（cotyledon）、幼葉（seedling leaf）、根（root）、莖（stem）、花苞（bud）、花（flower）、受精后20 d角果（20 DAP silique）、受精后30 d種子（30 DAP seed）等組織器官中的表達情況。

1.2.4 BnNF-YA1過表達載體的構建和遺傳轉化 利用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent試劑盒抽提甘藍型油菜Darmor-bzh的總RNA，并使用HiScript? Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒對總RNA樣品進行反轉錄獲得cDNA。利用基因特異性引物（BnNF-YA1-F：5′-GCTTCACGGCTCTTCTAA-3′，BnNF-YA1-R ：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′），以 cDNA 為模板，用 Phanta Max Super-Fideity DNA Polymerase對BnNF-YA1的CDS片段進行PCR擴增，利用酶切連接法（Pac I、Asc I雙酶切）將測序驗證無誤的目標片段構建到pMDC83骨架載體上，構建獲得BnNF-YA1過表達載體，命名為BnNF-YA1-OE。

使用電擊轉化法將BnNF-YA1-OE載體轉化至農桿菌GV3101感受態細胞中，利用含有卡那霉素（kanamycin，Kan）和利福平（rifampicin，Rif）的LA培養基篩選陽性克隆，并利用菌落PCR進行陽性鑒定（鑒定引物為 35S-F ：5′-CAAGACCCTTCCTCTAT-3′；BnNF-YA1-R：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′），將陽性農桿菌菌株保存于-80℃備用。利用農桿菌侵染法將BnNF-YA1-OE載體轉化到甘藍型油菜中，轉化過程在華中農業大學遺傳改良國家重點實驗室報道的方法基礎上對激素濃度略有調整［41］。

1.2.5 轉基因植株的分子鑒定 取轉基因植株的葉片抽提DNA［42］，并進行PCR陽性鑒定（使用引物為：35S-F ：5′-CAAGACCCTTCCTCTAT-3′；BnNF-YA1-R ：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′）。 利 用 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent試劑盒，對轉基因陽性植株和陰性對照植株抽提葉片總RNA，并使用HiScript? Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒進行反轉錄。利用qPCR檢測BnNF-YA1在轉基因植株中的表達量（定量引物為BnNF-YA1-QF：5′-CTTCAGGTGCACCATAAT-3′；BnNF-YA1-QR ：5′-CTAACACCTAACATCACT-3′），以 BnActin 作為內參基因（定量引物為Actin-F：5′-TCTTCCTCACGCTATCCTCCG-3′；Actin-R ：5′-AGCCGTCTCCAGCTCTTGC-3′），采用 2-△△CT法計算目的基因相對表達水平［43］。

1.2.6 甘藍型油菜逆境脅迫表型鑒定 選取BnNFYA1表達量較高的3個轉基因陽性過表達T2代株系（分別命名為BnNF-YA1-OE-1、BnNF-YA1-OE-2和BnNF-YA1-OE-4），以J9712為對照，進行子葉期逆境脅迫表型鑒定。選取狀態一致的J9712和BnNFYA1-OE種子接種到1/2 MS培養基上，培養24 h后將萌發狀態相對一致的種子轉移到無菌1/2 MS培養基和分別含有15% PEG和20 μmol/L甲基紫精（methyl viologen，MV）的1/2 MS培養基上，每個培養罐平均分為4個區域，分別均勻接種J9712、BnNFYA1-OE-1、BnNF-YA1-OE-2和BnNF-YA1-OE-4，每個培養罐中每個材料接種15顆種子，置于16 h光照/8 h黑暗條件下培養7 d，記錄幼苗的生長情況。

1.2.7 BnNF-YA1的轉錄激活活性分析 構建pGBKT7-BnNF-YA1載體，利用酵母快速轉化方法將pGBKT7-BnNF-YA1質粒轉化到Y2HGold酵母菌株感受態細胞中，挑取陽性酵母轉化子接種于液體培養基中培養并按梯度稀釋后打點于SD/-Trp、SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp和SD/-His/-Ade/-Trp固體培養基上，30℃倒置培養3-5 d，觀察酵母菌生長情況。

1.2.8 BnNF-YA1的亞細胞定位分析 構建C端融合GFP的BnNF-YA1表達載體，命名為35S∶BnNFYA1-GFP，將該載體轉化農桿菌GV3101感受態細胞并挑取陽性克隆進行保種。利用農桿菌侵染介導的煙草表皮瞬時表達體系對BnNF-YA1蛋白進行亞細胞定位分析，對照注射包含空載體35S∶GFP的GV3101農桿菌菌液。利用Zeiss LSM 880NLO雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光在煙草表皮細胞中的分布情況。

2 結果

2.1 BnNF-YA1生物信息學分析

2.1.1 理化性質分析 通過Protpraram對BnNF-YA1進行理化性質分析，結果表明，BnNF-YA1開放讀碼框為858 bp；分子式為C1320H2046N412O435S13；編碼285個氨基酸，其中纈氨酸的含量最多，帶負電荷的殘基（Asp、Glu）一共有36個，帶正電荷的殘基（Arg、Lys和His）有43個；BnNF-YA1蛋白質的相對分子質量為31.064 kD；理論等電點為6.11。

2.1.2 親/疏水性分析和跨膜結構分析 利用Expasy對BnNF-YA1蛋白親/疏水性進行分析，如圖1-A所示，BnNF-YA1蛋白在第21個氨基酸的分值為-2.878，在第134個氨基酸的分值為1.500，分別表示最低值和最高值，從整體上分析，BnNF-YA1蛋白的氨基酸分值大部分為負值，即親水性氨基酸在肽鏈中的含量較高，親水性氨基酸的平均分值也大于疏水性氨基酸的平均分值，因此，推測BnNFYA1為親水性蛋白質。對BnNF-YA1進行跨膜結構分析，結果表明，BnNF-YA1整條肽鏈不存在跨膜區域，存在跨膜結構的可能性低于0.001，可推測BnNF-YA1不屬于跨膜蛋白。

圖1 BnNF-YA1親/疏水性、磷酸化位點、二級結構、三級結構分析Fig.1 Analysis of hydrophilicity/hydrophobicity，phosphorylation site，secondary structure and tertiary structure of BnNF-YA1

2.1.3 磷酸化位點結構預測 對BnNF-YA1蛋白磷酸化位點進行在線預測，結果（圖1-B）顯示，3S、5S、48S、55S、56S、65S、70S、90S、94T、98S、115S、143Y、148Y、173T、180T、185Y、232S、240T、261S、263T、265S、266S、268S、273T、278T被預測為潛在的磷酸化位點，分數均高于閾值（0.500），其中232S的得分為0.995，表明BnNFYA1很可能存在多個磷酸化位點。

2.1.4 二級結構與三級結構預測 對BnNF-YA1二級結構進行分析，結果（圖1-C）顯示，BnNF-YA1主要由28.77%的α螺旋（包含82個氨基酸）、4.56%的延伸鏈（包含13個氨基酸）、3.16%的β轉角（包含9個氨基酸）以及63.51%的無規卷曲（包含181個氨基酸）等4個部分共同組成。對BnNF-YA1進行三級結構預測的結果如圖1-D所示，預測結果顯示，BnNF-YA1蛋白第180-285位氨基酸區段存在一個功能域，負責識別或者結合真核基因啟動子區域的CCAAT順式作用元件，在特定的時間與空間激活或者抑制目的基因的表達。

2.1.5 功能域與信號肽預測 對BnNF-YA1保守結構域進行分析，發現BnNF-YA1在第180-235位氨基酸區域存在保守的CBFB_NFYA結構域，屬于CCAAT結合蛋白家族。進一步的信號肽預測表明，該蛋白不存在信號肽。

2.1.6 NF-YA1序列比對和系統發生分析 利用BnNF-YA1全長蛋白對應的氨基酸序列在NCBI中進行Blast檢索，獲取多個植物物種中NF-YA1的同源蛋白序列，選取包括甘藍、白菜、水稻、玉米、擬南芥、大豆等物種在內的6條序列進行多序列比對（部分比對結果如圖2），并構建系統發生樹（圖3），BnNF-YA1與同為十字花科的甘藍中的BoNF-YA1親緣關系較近，而與其他植物中同源蛋白的親緣關系較遠。

圖2 BnNF-YA1同源序列比對Fig.2 Multiple sequence alignments of BnNF-YA1 and its homologs

圖3 NF-YA1系統發生分析Fig.3 Phylogenetic analysis of NF-YA1 proteins

2.2 基因表達分析

為探究BnNF-YA1的生物學功能，對BnNF-YA1在各種逆境脅迫處理條件下以及甘藍型油菜不同生長發育時期各組織器官中的表達模式進行分析（圖4-A），BnNF-YA1對多種逆境脅迫處理均表現出了不同程度的響應：受NaCl、PEG處理、高溫脅迫和ABA處理誘導上調表達，而受冷脅迫誘導下調表達，說明BnNF-YA1很有可能在甘藍型油菜響應逆境的過程中發揮作用。在PEG模擬干旱脅迫處理條件下，BnNF-YA1的表達隨著脅迫程度的加深不斷上升，在重度脅迫條件下其表達達到峰值。在高溫脅迫和ABA處理條件下，BnNF-YA1的表達則表現出先上升后回落的趨勢。對BnNF-YA1時空表達模式分析，結果（圖4-B）顯示，BnNF-YA1在油菜各組織器官中均有不同程度的表達，其在幼葉、花苞和受精后20 d的角果中表達水平較高，暗示其可能在相應的生長發育階段發揮功能。

圖4 BnNF-YA1表達模式分析Fig.4 Expression profile of BnNF-YA1

2.3 過表達材料獲得

以甘藍型油菜下胚軸為外植體，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將BnNF-YA1-OE過表達載體（載體骨架如圖5-A）導入油菜中，依次經過侵染、共培養、篩選、分化、生根等過程，獲得24株再生植株。對再生植株進行PCR陽性鑒定（圖5-B），除10、14外，其余的均為陽性轉基因苗，陽性率為91.66%。

對轉基因植株抽提RNA（圖5-C）并進行反轉錄（圖5-D），利用qPCR對陰性對照植株和部分陽性植株中BnNF-YA1的表達水平進行檢測（圖5-E），與對照相比，BnNF-YA1在轉基因陽性植株中的表達量均有不同程度的升高。

圖5 BnNF-YA1-OE過表達材料獲得Fig.5 Generation of BnNF-YA1-OE transgenic rapeseed plants

2.4 子葉期表型鑒定

為了研究BnNF-YA1在甘藍型油菜逆境應答中的作用，選取BnNF-YA1表達水平較高的3個株系 BnNF-YA1-OE-1、BnNF-YA1-OE-2和 BnNF-YA1-OE-4進行繁種，并對T2代材料進行了培養基上的脅迫處理試驗。如圖6-A所示，在正常條件下，對照J9712與BnNF-YA1-OE轉基因株系幼苗的根長、下胚軸以及鮮重沒有明顯差異；但在15% PEG和20 μmol/L MV處理7 d后，與對照相比，BnNF-YA1-OE幼苗的下胚軸顯著長于對照，說明15% PEG模擬的干旱脅迫和20 μmol/L MV的氧化脅迫對BnNF-YA1-OE材料生長的抑制程度比對J9712生長的抑制程度輕，說明過表達BnNF-YA1使甘藍型油菜對滲透脅迫和氧化脅迫的耐受性增強，BnNF-YA1正調控甘藍型油菜對PEG和氧化脅迫的耐受性。

圖6 BnNF-YA1-OE T2代轉基因植株子葉期表型鑒定Fig.6 Phenotypic identification of T2 generation of BnNFYA1-OE transgenic plants at the cotyledon stage

2.5 亞細胞定位

為研究BnNF-YA1蛋白的特性，構建了C端融合GFP的BnNF-YA1亞細胞定位載體并轉化農桿菌，利用煙草表皮細胞進行瞬時表達，培養36 h后，利用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發現GFP熒光信號位于細胞核（圖7），說明BnNF-YA1蛋白定位在細胞核中。

圖7 BnNF-YA1蛋白亞細胞定位Fig.7 Subcellular localization of BnNF-YA1 protein

2.6 轉錄激活活性檢測

為了分析BnNF-YA1蛋白的轉錄激活活性，構建pGBKT7-BnNF-YA1載體并利用酵母系統進行轉錄激活活性分析（圖8），包含pGBKT7-BnNF-YA1質粒的陽性酵母轉化子在SD/-Trp培養基上長勢正常，而在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His/-Ade缺陷型培養基上均不能生長，說明BnNF-YA1全長蛋白沒有轉錄激活活性。

圖8 BnNF-YA1全長蛋白自激活活性分析Fig.8 Transactivation activity analysis of BnNF-YA1 fulllength protein

3 討論

NF-YA類轉錄因子被報道在植物逆境應答過程中發揮重要作用，然而，該家族轉錄因子在油菜逆境應答中的功能研究還十分有限，有待深入。本研究中克隆的BnNF-YA1編碼的蛋白質在第180-235位氨基酸區域存在保守的CBFB_NFYA結構域，屬于NF-YA家族轉錄因子。從系統發生關系來看，BnNF-YA1與同為十字花科的甘藍XP_013611224.1親緣關系較近，而與其他植物的NF-YA1蛋白親緣關較遠，推測BnNF-YA1與XP_013611224.1在進化上具有相同的祖先。

根據前人的研究報道，NF-YA蛋白通常定位于細胞核中［44］。為了明確BnNF-YA1的定位情況，本研究利用煙草表皮細胞瞬時表達系統分析了BnNFYA1蛋白在亞細胞水平的分布，發現BnNF-YA1蛋白定位于細胞核內，這也與生物信息學分析表明該蛋白不具有跨膜結構域的結果相符，說明BnNFYA1在細胞核內發生作用，符合典型的轉錄因子亞細胞定位特征。為了進一步了解BnNF-YA1蛋白的特性，利用酵母系統對其進行轉錄激活活性檢測，結果顯示，BnNF-YA1全長蛋白并不具有轉錄激活活性。前人研究結果表明NF-YA是組成NF-Y三聚體蛋白的一個亞基，完整的NF-Y因子常常具有轉錄激活活性［12］。因此，推測NF-Y三聚體發揮轉錄激活功能很可能需要NF-YA和NF-YB/C的協同作用，BnNF-YA1亞基無法獨立發揮轉錄激活的功能。此外，還存在另外一種可能性，即BnNF-YA1是一個轉錄抑制子。

通過對BnNF-YA1進行表達分析，發現BnNFYA1對多種非生物脅迫和ABA處理均表現出響應，在PEG、高溫脅迫和ABA處理條件下其表達水平上調，而在冷脅迫處理條件下其表達水平下調，暗示該基因在甘藍型油菜對干旱、高溫和低溫脅迫響應過程中可能發揮重要的調控作用。進一步轉基因功能驗證的結果顯示，過表達BnNF-YA1的T2代植株在面臨15% PEG模擬干旱脅迫和20 μmol/L MV氧化脅迫時，下胚軸顯著長于對照植株的下胚軸，說明其過表達植株在脅迫條件下受到的氧化損傷較輕，說明過表達BnNF-YA1在一定程度上增強了甘藍型油菜對滲透脅迫和氧化脅迫的抗性。已有研究證實，利用NF-YA基因能夠有效提高植物對非生物脅迫的抗性。例如：在擬南芥中異源過表達BnNFYA9使得轉基因植株對NaCl和甘露醇等非生物脅迫以及ABA處理的抗性增強，在NaCl和ABA處理條件下，過表達BnNF-YA9擬南芥種子的萌發速度、根的伸長率、植株的根系等指標均比野生型的相應指標表現更好［45］。異源過表達SiNF-YA5可提高擬南芥的抗鹽性，在高鹽處理條件下，與野生型擬南芥相比，過表達SiNF-YA5的轉基因材料種子萌發率提高，苗期根表面積、植株鮮重顯著增加［46］。菊花DgNF-YA1基因可以調控抗寒相關基因的表達，從而正調控菊花的耐寒性［47］。本研究結果顯示，BnNFYA1正調控甘藍型油菜對滲透脅迫和氧化脅迫的抗性，有望作為提高油菜抗逆性的有利遺傳資源。目前，BnNF-YA1參與甘藍型油菜逆境應答的分子機制尚未明確。BnNF-YA1在甘藍型油菜中能夠與哪些NFYB/NF-YC因子發生相互作用？BnNF-YA1通過調控哪些下游靶基因來參與油菜逆境應答？這些都是在后續研究中值得關注的問題。

4 結論

從甘藍型油菜中克隆到BnNF-YA1基因，開放讀碼框序列為858 bp，編碼285個氨基酸，存在保守的CBFB_NFYA結構域，屬于NF-YA家族。BnNF-YA1受PEG處理、高溫脅迫和ABA處理誘導上調表達，且在幼葉、花苞以及受精后20 d的角果中表達水平較高。BnNF-YA1蛋白定位在細胞核中，其全長蛋白沒有轉錄激活活性，過表達BnNF-YA1能夠在一定程度上增強甘藍型油菜對PEG和MV處理的耐受性，BnNF-YA1參與調控甘藍型油菜對滲透脅迫和氧化脅迫的抗性。