利用基因編輯技術研究BRANCHED1參與油菜分枝過程的調控

Olalekan Amoo 胡利民 翟云孤 范楚川 周永明

（1.華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室，武漢 430070；2.湖北洪山實驗室，武漢 430070）

植物分枝是指葉腋處的腋生分生組織起始并形成腋芽，腋芽快速生長發育形成側枝的過程。分枝是植物株型的一個重要特征，參與植物很多重要的生長過程，如植物葉面積的展開和分布，決定了光的截取和光合作用，進而影響花和果實的數量、果實的填充和產量［1-2］；分枝還會影響植物與野草競爭光源、影響害蟲的傳播等［3-4］。此外，對于一些觀賞植物，分枝決定了其觀賞品質。

油菜是我國重要的油料作物，其單株產量由單株有效角果數、每角果粒數和千粒重三大產量因素構成。植株株型形態特征如分枝數、分枝位置等性狀可以間接影響油菜產量。其中單株有效角果數與分枝密切相關，同時分枝還決定地上部分株型的形態。降低油菜分枝位置、增加有效分枝數不僅有利于植株抗倒性，還可以增加油菜單株產量［5-6］。目前關于油菜株型性狀的研究還較少，挖掘可利用的理想株型相關基因在油菜高產育種和實現機械化收割中具有重要的意義。

近些年，在分離和鑒定直接參與植株株型形成的基因方面的研究取得了較多進展，特別在與控制腋芽起始和生長、莖伸長和花序構型相關的基因研究方面。這些株型調控基因大部分在雙子葉植物和單子葉植物之間都是保守的，說明這些植物可能通過相似調控途徑來調控株型［7］。在控制植物分枝的基因中，最突出的是TEOSINTE BRANCHED1（TB1），它的同源基因在許多物種中都非常重要［8-9］。TB1同源基因在水稻中被稱為OsTB1或FINECULM1；在擬南芥、豌豆和番茄中被稱為BRANCHED1（BRC1）。眾所周知，BRC1基因在腋芽中特異表達，被認為是不同信號調控植物分枝的重要樞紐［10-14］。擬南芥中具有兩個BRANCHED基因，分別為BRC1和BRC2，它們編碼TCP（Teosinte branched/cycloidea/proliferating cell factor）轉錄因子。在擬南芥中，AtBRC1和 AtBRC2都負調控分枝［10，15］。然而，研究表明AtBRC1在腋芽發育中似乎比AtBRC2發揮更關鍵的作用［16］。目前在異源四倍體油菜中至今尚未有關于BRC1的研究報道，因此對該基因展開功能研究有助于揭示油菜中分枝形成的調控機理。

CRISPR/Cas9基因組編輯技術是目前在農作物遺傳改良中應用最廣泛的基因編輯技術。本研究欲利用CRISPR/Cas9技術在油菜中靶向突變BRC1基因，以期獲得油菜BRC1突變體，為闡釋BRC1的基因功能奠定基礎，并為株型育種提供寶貴的種質資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本實驗所用的遺傳轉化受體材料為半冬性甘藍型油菜品系甲9707（J9707），由華中農業大學周永明教授提供。遺傳轉化獲得的再生苗、繁殖的轉化苗后代和小區試驗在華中農業大學轉基因基地試驗田中進行。

1.1.2 菌株與載體 構建CRISPR/Cas9載體所用到的雙元載體pYLCRISPR/Cas9P35S-H（潮霉素抗性）和CRISPR/sgRNA載體pYLsgRNA-AtU3d/LacZ、pYLsgRNA-AtU3b、pYLsgRNA-AtU6-1 和pYLsgRNA-AtU6b-29（氨芐抗性）由華南農業大學劉耀光課題組提供；用于油菜轉化的農桿菌菌株GV3101由本實驗室保存；大腸桿菌菌株DH5α購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 編輯載體構建與轉化 靶點設計采用CRISPR-P 2.0（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）在線網站設計，靶點引物列于附表1。具體的構建流程參照Ma等［17］所描述的方法構建CRISPR/Cas9編輯載體，得到的編輯載體經過測序驗證后轉入農桿菌感受態，再通過油菜下胚軸遺傳轉化方法轉化油菜受體材料J9707。具體操作方法參考楊陽［18］的方法。

1.2.2 突變體的轉基因陽性鑒定和編輯鑒定 對獲得再生苗采用CTAB法提取植物基因組DNA，采用載體上的引物PB-L/R（表1）進行轉基因的陽性鑒定。對得到的陽性單株按照Liu等［19］的方法進行高通量測序，測序數據使用在線網站Hi-Tom（http://www.hi-tom.net/hi-tom/）分析每個單株的具體突變形式。

2 結果

2.1 甘藍型油菜BnaBRC1的基因克隆及序列分析

根據擬南芥ATBRC1（AT3G18550）序列信息，在甘藍型油菜基因組Darmor中blast比對到5個同源基因拷貝，分別為BnaC01g34090D、BnaA01g26700D、BnaC05g51920D、BnaCnng23770D和BnaA03g34820。設計引物（表1）對這5個拷貝進行基因克隆，得到這5個拷貝的基因序列。進一步構建BnaBRC1同源基因系統進化樹發現BnaC01g34090D和BnaA01g26700D相似性最高，在核苷酸和蛋白序列上相似性分別為97.9%和96.7%（圖1）。在受體材料J9707中進行同源基因DNA克隆和cDNA克隆，結果發現這5個同源基因都具有4個外顯子。通過MEME進行保守結構域分析，結果發現BnaBRC1中存在2個保守的motif，屬于glutamic acid-cysteine-glutamic acid motif（ECE）， 功能未知，位于保守TCP domain中（圖2-A），TCP domain位于第8-164個氨基酸之間（圖2-B）。

圖1 BnaBRC1蛋白系統進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of BnaBRC1 protein

圖2 BnaBRC1基因的Motif分析及保守結構域分析Fig.2 Motif analysis and conserved domain structures of BnaBRC1 gene

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

2.2 甘藍型油菜BnaBRC1的組織表達特異性分析

利用網上公開的甘藍型油菜中雙11的轉錄組數據庫（http://yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR/expression_show）對BnaBRC1基因在不同組織中表達水平進行分析，發現BnaA01g26700D和BnaC01g34090D的表達水平相對其他拷貝較高；且BnaBRC1基因的不同拷貝主要在花粉、花蕾和16 d-26 d的種子中有相對較高的表達，在其他組織中表達量很低或者不表達（圖3）。

圖3 BnaBRC1基因5個同源拷貝在油菜的不同組織中的轉錄豐度Fig.3 Transcript abundances of five BnaBRC1 copies in different tissues of B.napus

2.3 甘藍型油菜BnaBRC1多靶點的CRISPR/Cas9載體構建

在設計sgRNA靶點時，根據BnaBRC1基因的5個同源拷貝之間序列相似性分成兩組，設計兩個CRISPR/Cas9載體，分別靶向不同的同源拷貝（圖4-a）。第一組設計 3個 sgRNA 盒（S1-S3），分別靶 向BnaC01g34090D、BnaA01g26700D和BnaC-05g51920D，其中BnaC01g34090D命名為BnaC01.BRC1a（CC1），BnaA01g26700D 命 名 為 BnaA01.BRC1a（AA1），BnaC05g51920D 命 名 為 BnaC05.BRC1a（CC2）。該載體命名為P35s：Cas9-BnBRC1a（SBRC1a）（ 圖4-b）。 第 二 組 也 設 計 3個 sgRNA盒（S4-S6）， 分 別靶向 BnaC05g51920D、BnaCnng23770D和BnaA03g34820，其中BnaCnng23770D命 名 為 BnaCnn.BRC1b（CC3），BnaA03g34820命名為BnaA03.BRC1b（AA2），該載體命名為P35s：Cas9-BnBRC1b（SBRC1b）（圖4-b）。其中 sgRNA 靶向基因的位置信息和與基因序列的匹配程度如圖4-a所示。這兩個載體的sgRNA分別用擬南芥啟動子pU3d、pU3b和pU6-1啟動表達（圖4-b）。

圖4 BnaBRC1基因結構與靶點序列及雙元質粒載體示意圖Fig.4 BnaBRC1 gene structure with target sequences and schematics of binary plasmid vectors

2.4 BnaBRC1突變體的創建

將構建好的CRISPR/Cas9編輯載體通過農桿菌介導的下胚軸遺傳轉化法轉化甘藍型油菜受體J9707。其中SBRC1a載體共獲得100株再生苗，SBRC1b載體共獲得90株再生苗。利用載體引物PB-L/R（表1）對所有再生苗進行轉基因陽性檢查，結果SBRC1a和SBRC1b載體分別獲得80和70株轉基因陽性單株，轉基因陽性效率分別為80%和78%。

為進一步確定轉基因陽性單株的基因型，采用Hi-TOM兩輪PCR產物高通量建庫測序的方法［19］，分析每個單株的具體突變形式。結果SBRC1a和SBRC1b轉化載體分別檢測到11株和12株編輯單株，編輯效率分為13.8%和17.1%，其中SgRNA1（S1）和SgRNA5（S5）處沒有發生編輯。SBRC1a中BnaC01g34090D和BnaA01g26700D同時發生編輯的單株有11株，而BnaC01g34090D、BnaA01g26700D和BnaC05g51920D三個拷貝都發生編輯的單株僅有2株；SBRC1b中BnaCnng23770D和BnaA03g34820同時發生編輯的單株有11株，BnaCnng23770D單獨發生編輯的單株有1株，而沒有BnaCnng23770D、BnaA03g34820和BnaC05g51920D三個拷貝都發生編輯的單株。本研究中個別的靶點靶向不同同源拷貝的編輯效率有較大的差異，其中S2、S3靶點針對BnaC01g34090D和BnaA01g26700D的編輯效率明顯高于BnaC05g51920D，其余的靶點則沒有明顯的拷貝偏好性。

根據測序結果，發現CRISPR/Cas9介導的基因編輯在甘藍型油菜中引入的突變類型大多數為單個堿基的插入或缺失（圖5），少數情況為大片段缺失。

圖5 BnaBRC1突變體株系在T0代和T1代中S2和S3靶位點突變基因型Fig.5 Mutated alleles at the S2 and S3 target sites of BnaBRC1 mutants from T0 to T1 generation

2.5 BnaBRC1突變體表現為多主軸表型

由于疫情原因，只有部分T0代突變體材料得到自交種，其中在SBRC1a轉化載體中只獲得了BnaBRC1基因C01和A01同源拷貝同時突變的株系。而SBRC1b編輯轉化材料沒有收到種子，由于組織培養出來的再生苗表型受到很多因素的影響，故沒有收集T0代突變體的表型。對獲得的BnaC01g34090D和BnaA01g26700D拷貝突變體進行基因型鑒定，結果表明突變基因型可以從T0代穩定遺傳給T1代。在T1代對aa1AA2cc1CC2CC3突變體進行表型考察，發現相較于野生型材料，突變體平均株高只有93.7cm，為野生型材料的53.5%（圖6-A）；苗期葉片數為野生型材料的3倍（突變體平均葉片數為33，野生型材料平均葉片數為11）（圖6-A）；相對于野生型材料只有一個主軸，突變體有2-4個主軸（圖6-C），突變體的多分枝表型在植株成熟期依舊保持和苗期一樣的數目。以上結果說明，BnaBRC1同源基因中BnaC01g34090D和BnaA01g26700D拷貝對分枝數目的調控具有比較重要的作用。

圖6 BnaBRC1突變體的表型觀察Fig.6 Phenotypes of BnaBRC1 mutants

2.6 BnaBRC1編輯材料的脫靶檢測

為了檢測本研究中6個靶位點的脫靶情況，對S1-S6所有靶點進行脫靶檢測。利用CRISPR-P在線軟件預測每個靶點可能存在的小于5個堿基錯配的潛在脫靶位點。S1-S6分別對應有9、14、11、18、18個脫靶位點，我們對這70個潛在脫靶位點設計PCR擴增引物（附表1），分別對72、72、72、54、54株編輯單株進行PCR擴增，用PCR產物通過高通量測序。分析測序結果發現這70個潛在脫靶位點都沒有基因編輯發生（表2），說明這些靶點特異性較高，均沒有脫靶。

表2 在T0代突變體中檢測每個sgRNA的脫靶活性Table 2 Detection of potential off-target effects for each sgRNA target site in T0 mutated plants

3 討論

獲得特定基因的突變體并對其進行表型分析是鑒定基因功能非常有效的一種方式。而采用物理和化學誘變等傳統的方法創建突變體，不僅耗時費力、缺乏目標性，而且在突變體基因組中還存在大量的隨機突變［20-21］。油菜為異源四倍體油料作物，大多數基因都具有功能相似的多個同源拷貝。因此，要獲得具有表型變異的突變體，往往需要將這些功能冗余的拷貝同時突變才可能實現，進一步增加了利用傳統誘變方法鑒定油菜基因功能的難度。近年來發展起來的CRISPR/Cas9基因編輯技術能靶向特定的基因進行定點突變，很好的克服了傳統誘變方法的缺點，而且該技術易于掌握和操作，為油菜等多倍體作物的突變體創建和基因功能研究提供了強有力的工具［22-23］。

在本研究中，共設計了6個sgRNA表達盒靶向BnaBRC1基因，在T0代共獲得23株突變體，表明該方法的有效性。進一步分析發現各個靶點的編輯效率存在較大差異。這可能與Cas9和sgRNA的表達水平、靶點GC含量、靶向背景和靶向sgRNA的二級結構等因素相關［22-24］。

在創建的BnaBRC1突變體中，我們觀察到BnaC01g34090D和BnaA01g26700D雙基因純合突變體具有多分枝的表型，說明BnaBRC1基因的BnaC01g34090D和BnaA01g26700D同源拷貝對分枝數目的調控具有比較重要的作用。由于本研究中未能獲得該基因其它拷貝的純合突變體，因此這些拷貝是否具有調控分支的功能仍然未知。在后續研究中需要通過分離或聚合得到更多同源拷貝的單基因和多基因突變體，并對其進行表型考察以明確該基因各個同源拷貝的功能。此外，需要對獲得的BnaBRC1多主軸突變體進行綜合農藝性狀考察，明確該多主軸表型是否具有增產效益。

本研究驗證了BRC1的基因功能在不同物種中具有保守性，都參與腋芽的發育，從而調控分枝形成。研究表明BRC1的表達受到多種激素包括細胞分裂素、獨角金內酯及赤霉素的調控［25-27］。而油菜中BRC1的表達主要由哪些激素調控還未知，對BnaBRC1的調控機理仍需進一步的研究。

4 結論

本研究利用CRISPR/Cas9技術對甘藍型油菜中的BnaBRC1進行了定點突變。其中，BnaC-01g34090D和BnaA01g26700D雙拷貝純合突變體表現出明顯的多分枝表型，表明該基因的這兩個拷貝參與油菜中的分枝和株型調控。本研究為后續研究油菜的株型調控分子機理提供了重要研究材料。

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