狼瘡性腎炎腎小球系膜細胞增殖中HMGB1的作用機制研究

羅亞丹

(遵義市第一人民醫院(遵義醫科大學第三附屬醫院)腎內科，貴州 遵義 563000)

狼瘡性腎炎是免疫系統極為常見的危重癥，多以系統性紅斑狼瘡并發癥的形式出現，主要臨床表現為血尿、蛋白尿、腎功能不全及其他全身性表現[1]。目前，臨床治療系統性紅斑狼瘡主要原則是通過評估病情活動度，給予腎臟功能保護治療以及腎組織纖維化延緩控制[2]。高遷移率族蛋白B1是一種高度保守的核蛋白，被臨床證實參與DNA的轉錄及修飾等生物學功能，且具備晚期促炎作用，是研究價值極高的炎癥因子[3]。因此，本文分析高遷移率族蛋白B1(HMGB1)在狼瘡性腎炎(LN)中的促炎表達及其腎小球系膜細胞(HMC)增殖機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年3月至2018年2月我院收治的Ⅳ型狼瘡性腎炎患者35例，提取入選者癌旁遠端正常組織樣本作為對照組，提取入選者腎組織腎穿樣本為觀察組。入選者年齡為25～54歲，平均年齡(36.20±2.45)歲，男2例，女16例。納入標準：所有患者均符合美國風濕病學會1997年推薦的系統性紅斑狼瘡及狼瘡性腎炎診斷標準，即合并腎臟病變，表現為尿蛋白≧0.5 g/24 h或+++，或管型(紅細胞，血紅蛋白，顆粒管型或混合管型)，同時具備四條及以上系統性紅斑狼瘡診斷標準。入選者腎臟損害程度不一，病情分型為Ⅳ型即為硬化性狼瘡性腎炎。患者及家屬知情同意。

1.2研究材料 本研究所用材料包括艾博抗(上海)貿易有限公司提供的兔抗HMGB1單克隆抗體試劑盒、兔抗IkBα單克隆抗體試劑盒和兔抗p65多克隆抗體試劑盒，上海聯邁生物工程有限公司提供的SP法免疫組化試劑盒、上海研卉生物科技有限公司提供的EarthOxDylight649-山羊抗兔熒光二抗、艾美捷科技有限公司提供的艾美捷BiovisionBrdU細胞增殖檢測試劑盒。

1.3樣本分組 (1)組織樣本：取對照組正常組織、觀察組腎穿樣本進行對照研究。(2)細胞樣本：以采用重組人HMGB1蛋白刺激HMC細胞增殖，研究細胞增殖水平時，以空白組為對照樣本，不同刺激濃度組為觀察組，客觀記錄不同刺激時段細胞增殖水平；研究蛋白表達水平時，以空白組為對照樣本，不同時間點蛋白表達為觀察組。

1.4方法 (1)腎組織脫蠟水化：將腎組織進行石蠟切片處理并實施脫蠟水化，具體步驟如下：應用二甲苯脫蠟5 min，應用濃度為100%的乙醇水化5 min，再用濃度為95%的乙醇水化3 min，上述步驟各實施兩次，而后依次應用濃度為85%、80%、75%的乙醇各水化3 min即可。(2)免疫熒光抗體技術：取水化標本，應用枸櫞酸修復液0.01 mmol·L-1高壓修復5 min，而后將其放入溫度為37℃的正常山羊血清中密封保存1 h；將抗HMGB1抗體以1∶200的比例進行稀釋處理，并滴入標本中，置入恒溫箱中過夜處理，恒溫箱為4℃；以磷酸緩沖鹽溶液0.01 mmol·L-1浸洗三次，5 min/次；將山羊抗兔IgG以1∶200的比例進行稀釋處理，維持37℃恒溫避光孵育1 h；應用4，6-聯脒-2-苯基吲哚反復染色處理，而后借助熒光顯微鏡觀察標本，可見HMGB1蛋白陽性信號均呈紅色熒光。(3)免疫組織化學法:取水化標本，應用濃度為3%的過氧化氫避光孵育20 min，而后置入枸櫞酸修復液0.01 mmol·L-1高壓修復5 min，使其在室溫下自然冷卻；將標本放入溫度為37℃的正常山羊血清中密封保存1 h；將IκBα抗體以1∶200的比例進行稀釋處理，并滴入標本中，置入恒溫箱中過夜處理，恒溫箱為4℃；恒溫37℃狀態下各孵育30 min完成二抗、三抗處理，采用二氨基聯苯胺染色5 min，再用蘇木精染色2 min，而后置入淡氨水中30 s快速返藍，再應用鹽酸酒精分化處理30 s，待達到透明脫水狀態，滴入中性樹膠，蓋上蓋玻片進行封片處理。(4)BrdU細胞增殖檢測：按照1×105/孔標準將HMC細胞接種于96孔板，分別應用50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1的重組人HMGB1蛋白刺激HMC細胞，各組分別設置三個復孔；將標本置入濃度為5%的二氧化碳37℃恒溫孵育箱中進行培養，孵育1 h、3 h、7 h、11 h時，于復孔中滴入100μlBrdU參入液，分別于孵育2 h、4 h、8 h、12 h時收集細胞，并于復孔中滴入200μl固定液，在室溫下孵育30 min，而后應用WashingBuffer洗滌緩沖液反復沖洗三次，再經復孔滴入100μl二抗，在室溫下孵育30 min，再次沖洗后，滴入100μl過氧化物酶底物，在室溫下孵育30 min，此時可見增殖活躍的細胞孔呈藍色變化，而后，經復孔滴入100μl終止液，可見亮黃變化，應用酶標儀于450 nm處檢測標本光密度值。(5)Westernblot法:分別收集經重組人HMGB1蛋白刺激后不同時間點(0、10、20、30、40、50、60 min)的細胞，應用裂解液分化后，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白水平，而后用熱水煮沸，時間控制為5 min，以促使標本變性。提取樣品50 μg，應用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術分離蛋白，而后維持濕潤狀態將其轉移至聚偏二氟乙烯膜上，應用濃度為5%的脫脂奶粉在37℃恒溫狀態下封閉1 h，將IκBα、p65抗體以1∶1 000比例稀釋，并加入標本中，置入恒溫箱中過夜處理，恒溫箱為4℃；將用辣根過氧化物酶標記過的二抗以1∶5 000的比例稀釋，在37℃恒溫狀態下孵育2 h。采用Odyssey?Fc雙色紅外激光成像系統觀察顯像，定量分析對條帶，其中蛋白相對表達量為目的條帶積分光密度值與β-actin條帶積分光密度值的比值。

2 結 果

2.1統計兩組HMGB1和IκBα蛋白水平 在免疫熒光實驗中，觀察組HMGB1蛋白紅色細胞比例與對照組比較升高明顯(P<0.05)，定位偏向細胞核。在免疫組織化學實驗中，觀察組IκBα蛋白水平明顯低于對照組(P<0.05)，兩組定位均為細胞質。

2.2統計兩組HMC細胞增殖情況 分別應用100 μg·L-1、200 μg·L-1重組人HMGB1蛋白刺激8 h、12 h后，觀察組HMC細胞增殖水平明顯升高(P<0.05)，但與對照組比較差異不明顯(P>0.05)。見表1。

表1 兩組HMC細胞增殖情況

2.3統計兩組IκBα蛋白和p65蛋白水平 在重組人HMGB1刺激10 min及30 min后，觀察組IκBα蛋白水平明顯下降(P<0.05)，在重組人HMGB1刺激40 min鐘后，p65蛋白水平大幅上升(P<0.05)。

3 討 論

臨床研究證實，HMGB1以炎癥因子的形式參與了諸多疾病的發生和發展如呼吸系統、自身免疫性疾病、腫瘤疾病等[4-5]。隨著HMGB1晚期促炎作用浮出水面，臨床越來越多的危重醫學研究學者熱衷于HMGB1作用機制的研究[6]。湯婷[7]曾在研究中指出，“HMGB1不僅可以直接充當炎性細胞因子參與固有免疫應答，也可作為內源性的免疫佐劑激活抗原遞呈細胞，啟動適應性免疫應答，參與多種疾病的發生和發展”，并認為臨床探究HMGB1與狼瘡性腎炎的內在聯系能夠為揭示該疾病的發病過程提供參考依據，為靶向治療提供全新思路。

狼瘡性腎炎是系統性紅斑狼瘡最為常見的并發癥，其主要病理特征即為腎小球細胞過度增殖[8-9]。另外，腎小球細胞增殖已被作為檢驗腎臟病理活動指數的重要參考指標[10-11]。本研究結果發現，觀察組HMGB1蛋白紅色細胞比例與對照組比較升高明顯(P<0.05)，定位偏向細胞核，表明狼瘡性腎炎患者體內HMGB1異常上升，同時再次證實HMGB1存在于細胞核內。另外，重組人HMGB1刺激能夠誘導HMC增殖水平升高，提示HMGB1參與狼瘡性腎炎的發病。在免疫組織化學實驗中我們發現，與對照組比較，觀察組p65蛋白水平升高明顯，同時IκBα水平大幅下降(P<0.05)，提示IκBα蛋白可能在某種機制下被降解。(P<0.05)，正常狀態下，由IκB和NF-κB構成失活三聚體，而一旦IκB被降解，則會釋放NF-κB，激活其核轉錄因子作用。值得一提的是，NF-κB被證實與免疫性疾病的發病存在密切聯系[12-14]，這便提示HMGB1增殖狼瘡性腎炎系膜細胞作用可能是通過激活細胞內NF-κB信號通路實現的[15-16]。

綜上，以活化NF-κB信號通路進而加快狼瘡性腎炎患者腎小球系膜細胞增殖速度可能是高遷移率族蛋白B1促炎機制的一種表達形式。