血小板/淋巴細胞比值和中性粒細胞/淋巴細胞比值與膽道癌患者PD-1抑制劑治療的預(yù)后分析

范潤佳，林萬程，茍苗苗，閆 歡，千年松

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心 呼吸學(xué)部腫瘤內(nèi)科，北京 100094；3 北京大學(xué)第九臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100000；4 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 V 腫瘤內(nèi)科，北京 100071；5 解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，海南三亞 572000

膽道癌(bile tract carcinoma，BTC)是一種罕見的惡性腫瘤。在過去30 年中，BTC 的發(fā)病率一直在上升，從1/100 000 增加至6/100 000[1-2]。約70%的BTC 患者在確診時已失去根治性手術(shù)機會[3-4]。術(shù)后患者的1 年復(fù)發(fā)率可達67%[5]。因此，大多數(shù)BTC 患者須接受全身治療。目前全身治療的總體生存獲益有限，5 年生存率不超過15%，其預(yù)后往往很差[6]。BTC 需要更有效的藥物治療。近年來隨著靶向治療和PD-1 抑制劑治療的興起，治療方案也在不斷變化[7]。目前多項臨床試驗表明，在BTC 患者中PD-1 抑制劑與化療或靶向治療的聯(lián)合使用獲得了令人鼓舞的效果[7-8]。考慮到高昂的治療費用及免疫治療無效超進展可能，有效且精準的標志物成為篩選獲益患者的最佳選擇。不同于基因突變預(yù)測靶向治療療效，免疫治療預(yù)測因素復(fù)雜程度更高：腫瘤細胞的PD-L1表達、組織中TMB 以及腸癌中微衛(wèi)星穩(wěn)定狀態(tài)是目前預(yù)測指標中應(yīng)用最廣的[9-11]，但這三者均屬于有創(chuàng)檢測，且受到時間動態(tài)變化、不同閾值及不同檢測方法的限制。因此，探索易在常規(guī)臨床環(huán)境中評估的預(yù)后指標，更有利于實現(xiàn)精準治療。一些研究表明，血清炎性標志物可用于PD-1 抑制劑治療的療效預(yù)測，如絕對中性粒細胞計數(shù)、中性粒細胞與淋巴細胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)、血小板與淋巴細胞比值(platelet-tolymphocyte ratio，PLR)、單核細胞與淋巴細胞比值等[12-15]。NLR 和PLR 是幾種應(yīng)用PD-1 抑制劑治療的實體瘤的預(yù)后標志物，較高的NLR 和PLR往往與較差的總生存(overall survival，OS)及無進展生存(progress free survive，PFS)相關(guān)[16-19]。但目前尚缺乏探討基線NLR 和PLR 與接受PD-1 抑制劑治療的BTC 患者預(yù)后的研究。因此，我們的研究擬分析基線NLR 和PLR 及二者聯(lián)合指標對接受PD-1 抑制劑治療的BTC 患者預(yù)后的影響。本研究根據(jù)NLR、PLR 的最佳截斷值將所有患者分為高水平組和低水平組，聯(lián)合指標CNP(combination of NLR and PLR)是由患者基線NLR 和PLR 的水平定義，兩項指標均高的患者歸為High CNP 組，一項不高/兩項均不高的患者歸為Median CNP 組/Low CNP 組。

資料與方法

1 資料 回顧性分析2017 年1 月- 2021 年4 月解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心就診BTC 患者(共84 例)的臨床資料。納入標準：1)病理明確診斷為肝內(nèi)膽管癌、肝外膽管癌或膽囊癌；2)接受了至少兩個周期的PD-1 抑制劑治療；3)治療期間至少完成1 次基于RECIST1.1 標準的影像學(xué)療效評估；4)首次使用PD-1 抑制劑前的1 周內(nèi)血常規(guī)及血生化結(jié)果完整。排除標準：1)無可評估病變；2)合并感染、自身免疫性疾病或特發(fā)性血小板計數(shù)減少性紫癜；3)患者體力狀態(tài)評分(ECOG PS)＞2，中性粒細胞計數(shù)＜1.5×109/L，血小板計數(shù)＜100×109/L；4)合并其他腫瘤及心力衰竭、肝腎功能障礙等嚴重內(nèi)科疾病。

2 治療方案 PD-1 抑制劑治療劑量及周期取決于特定藥物，2 周方案：納武利尤單抗為240 mg/次；3 周方案：帕博利珠單抗為3 mg/kg；信迪利單抗200 mg/周期；特瑞普利單抗240 mg/周期。

3 ROC 分析及分組 以患者到達總體PFS 中位數(shù)時是否發(fā)生疾病進展為狀態(tài)變量，以治療前NLR 及PLR 為檢驗變量，繪制ROC 曲線(圖1)，得到最佳Cut-off 值，以根據(jù)此Cut-off 值進行NLR 及PLR 指標不同水平的分組，結(jié)果基于NLR 預(yù)測6 個月疾病進展的AUC 為0.726(Se=59.5%，Sp=90.5%)，基于PLR 預(yù)測6 個月疾病進展的AUC 為0.702(Se=69.0%，Sp=71.4%)。NLR最佳Cut-off 值為2.295，PLR 為147.954。84 例患者按以下標準分組。A，單純根據(jù)NLR 值，將患者分為以下2 組：1)High PLR(＞147.954，n=43)；2)Low PLR(≤147.954，n=41)；B，單純根據(jù)PLR值，將患者分為以下2 組：3) High NLR(＞2.295，n=55)；4)Low NLR(≤2.295，n=29)；C，再按NLR和PLR 及二者聯(lián)合指標CNP，將患者分為以下3 組：5)High CNP(PLR＞147.954 且NLR＞2.295，即“兩者皆大”，n=36)；6)Median CNP(PLR＞147.954 或NLR＞2.295 即“兩者有一大”，n=26)；7) Low CNP(PLR≤147.954 且NLR≤2.295，即“兩者皆小”，n=22)。

圖1 基線NLR(A)和PLR(B)預(yù)測6 個月內(nèi)疾病進展的ROC 曲線Fig.1 ROC curves of the pretreatment NLR (A) and PLR (B)predicting progression of patients with BTC in 6 months

4 觀察指標 1)臨床特征和腫瘤特征：包括性別、年齡、吸煙情況、ECOG 體力狀態(tài)評分、原發(fā)腫瘤位置、病理分型、轉(zhuǎn)移器官、治療方案、不良反應(yīng)及基線全血細胞計數(shù)等。分析多線治療及合并用藥對PLR 及NLR 的分布影響。2)不同組別的疾病控制率(disease control rate，DCR)：定義為所有治療患者中達到完全緩解(complete response，CR)，部分緩解(partial response，PR)或疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)的患者比例。3) 不同組別的PFS：定義為PD-1 抑制劑開始使用日期與疾病進展日期之間的時間。功能狀態(tài)評分(performance status，PS)的惡化被歸類為疾病進展。4)PD-1 治療預(yù)后的影響因素分析。

5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS9.2 及MEDCALC11.9.6軟件處理數(shù)據(jù)。連續(xù)變量以Md(IQR)或±s表示，分類變量報告頻率和百分數(shù)。PFS 差異比較采用生存分析及l(fā)og-rank 檢驗。采用Cox 模型進行單因素及多因素分析，篩選影響預(yù)后的自變量及計算其危險比。客觀緩解率(objective response rate，ORR)及DCR 等定性資料采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 患者臨床特征 本研究共納入BTC患者84 例，中位年齡59.5 歲，男性48 例，女性36 例。肝內(nèi)BTC 29 例，肝外BTC 55 例，52 例治療前已發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，23 例肺轉(zhuǎn)移，24 例骨轉(zhuǎn)移，37 例為多發(fā)轉(zhuǎn)移。51 例在一線治療中應(yīng)用了PD-1 抑制劑，見表1。治療線及合并用藥對PLR、NLR 分布進行了比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表1 BTC 患者基線臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of the BTC patients

表2 膽道癌患者基線特征與NLR 或PLR 的關(guān)聯(lián)(n)Tab.2 Association of baseline characteristics of the BTC patients with NLR or PLR (n)

2 PD-1 抑制劑治療后的疾病控制率 84 例中，2 例CR，11 例PR，32 例SD，總 體ORR 為15.5%，DCR 為53.5%。17 例發(fā)生免疫相關(guān)不良反應(yīng)，其中胃腸道毒性7 例，肝功能異常4 例，發(fā)熱3 例，甲狀腺功能減退3 例。療效評估低PLR 組的DCR 大于高PLR 組(65.8%vs42.8%，P=0.028)。低NLR 組的DCR 大于高NLR 組(68.9%vs45.4%，P=0.040)，Low CNP 組的DCR 顯著優(yōu)于High/Median 組(69.2%vs43.5%，P=0.025)。其ORR 達到27.2%，雖高于其他組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.075)。見表3。

表3 PLR 組NLR 組及CNP 組的BTC 患者疾病反應(yīng)率Tab.3 Response rate of the BTC patients according to PLR,NLR and CNP

3 PFS 結(jié)果分析 Low NLR組較High NLR 組的PFS 更長(10 個月vs5 個月，P＜0.001)。Low PLR組較High PLR組中位PFS更長(9 個 月vs4 個月，P＜0.001)。比較CNP 三組，Low CNP 組至High CNP 組PFS 依次下降，其中Low CNP 組中位PFS 顯著長于Median CNP 組(10 個月vs6 個月，HR=0.416，95%CI：0.245～0.707)，P＜0.001。High CNP 組與Median CNP 組中位PFS 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(4 個月vs6 個月，HR=1.063，95%CI：0.560～2.016)。見圖2。

圖2 不同PLR(A)、NLR(B)及CNP(C)分組的無進展生存曲線Fig.2 Progression-free survival curves stratified by PLR (A),NLR (B),and a combination of PLR and NLR (C) in BTC patients

4 影 響PFS的單因素及多因素Cox分析年齡、NLR 及PLR 是PFS 的獨立危險因素。盡管年齡與PFS 顯著負相關(guān)(HR=1.035，95%CI：1.009 ～1.061，P＜0.001)，但 PFS 與 NLR(HR=1.517，95%CI：1.037 ～2.217，P＜0.001)和PLR(HR=1.802，95%CI：1.091～2.975，P＜0.001)的相關(guān)性更強。在多變量分析中，NLR 和年齡依然是PFS 的獨立影響因素。見表4。

表4 影響B(tài)TC 患者無進展生存期的單因素和多因素分析Tab.4 Univariable and multivariable analyses of factors associated with PFS for the BTC patients

討論

PD-1 抑制劑已徹底改變了多種實體瘤中少數(shù)患者的治療格局。在BTC 散發(fā)病例中也觀察到了一定療效，但總體效果仍存在爭議。選擇有效標志物對篩選BTC 免疫治療的最佳獲益人群十分必要。PD-L1 的表達、腫瘤微環(huán)境中CD8+T 細胞和高腫瘤突變負荷是目前應(yīng)用最廣的PD-1 抑制劑療效預(yù)測指標[20-22]。但它們?nèi)匀粵]有在臨床實踐中廣泛應(yīng)用，部分原因是成本高或缺乏標準化，因此有必要充分利用常規(guī)臨床指標來預(yù)測預(yù)后。

中性粒細胞、淋巴細胞和血小板是外周血的3 個主要亞群。淋巴細胞在腫瘤免疫中具有核心作用，其激活和腫瘤內(nèi)浸潤是抗腫瘤免疫反應(yīng)所必需的，增加腫瘤區(qū)域的淋巴細胞浸潤對實體瘤的治療反應(yīng)更好，淋巴細胞減少反映細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)受損[23]。同時，免疫反應(yīng)是淋巴細胞與其他調(diào)節(jié)細胞之間相互作用的結(jié)果。首先，腫瘤內(nèi)中性粒細胞(intratumoral neutrophils，TANs)在腫瘤進展中起著雙刃劍的作用。先前的研究表明，盡管CD11b+/Ly6G+TANs 對腫瘤細胞具有細胞毒性，但TANs 也可以通過影響腫瘤微環(huán)境參與腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[24-25]。如Kargl 等[26]研究結(jié)果表明較高的TANs 直接影響腫瘤細胞，減少TME 中的CD8+T 細胞可抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。其次，Guan等[27]研究表明循環(huán)的中性粒細胞可通過釋放中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)促進腫瘤細胞的增殖轉(zhuǎn)移。因此，升高的NLR，無論是中性粒細胞增加還是淋巴細胞減少，都可能導(dǎo)致患者對PD-1 抑制劑的反應(yīng)不佳。這可能部分解釋了為什么NLR 升高與更差的疾病控制率相關(guān)。本研究結(jié)果同樣顯示應(yīng)用PD-1 治療的BTC 患者，高基線NLR 組有更大概率發(fā)生疾病進展與不良預(yù)后。

血小板是炎癥反應(yīng)的一部分，反應(yīng)性血小板增多癥在實體瘤中很常見[28]，這是在高細胞因子血癥的背景下腫瘤與宿主相互作用誘導(dǎo)的結(jié)果，其中IL-6 起著重要作用[29]。同樣，IL-6 不僅能誘導(dǎo)巨核細胞分化為血小板，還能誘導(dǎo)中性粒細胞增殖。Caudrillier 等[30]研究表明血小板可能與中性粒細胞相互作用促進NETs 的釋放，這可能是PLR 可以一定程度反映機體的免疫炎癥狀態(tài)的原因。Diem 等[16]的研究根據(jù)PLR 的三分位數(shù)(PLR＜193、PLR 193～328 和PLR＞328)將患者細分為三組，表明PLR 值較高的患者OS 和ORR較差。同時Russo 等[17]證明基線 PLR ≥200 且接受納武利尤單抗治療的非小細胞肺癌患者與更差的ORR、DCR、PFS、OS 相關(guān)。本研究中，高于147.954 的基線PLR 與更差的PFS(P＜0.05)和更低疾病控制(P=0.028)相關(guān)。DCR 和PFS 趨勢與之前研究類似，但ORR 差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

盡管目前已有部分關(guān)于NLR 和PLR 影響實體瘤預(yù)后的研究，但尚缺乏聯(lián)合指標CNP 與免疫治療預(yù)后的相關(guān)性研究，本研究分析表明CNP 對BTC 患者預(yù)后的敏感度更高。Low CNP 組患者的中位生存期和疾病反應(yīng)率明顯高于其他組，這與Graziano 等[31]關(guān)于NLR 聯(lián)合PLR 預(yù)測乳腺癌新輔助化療預(yù)后的研究結(jié)果相似。同時，先前一項關(guān)于非小細胞肺癌的預(yù)后因素研究提示PLR 是NLR 的一個補充預(yù)后因素，推測NLR 升高部分抵消了PLR 對生存預(yù)測的影響，當NLR 降低時，PLR 升高的患者較PLR 未升高的患者生存率更低[32]。本研究結(jié)果與其有相似的趨勢，Low CNP組與Median CNP 組相比，患者表現(xiàn)出明顯的生存獲益，而Median CNP 與High CNP 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明NLR 和PLR 均低于截斷值的BTC患者有更大概率從免疫治療中獲益。

Kasanen 等[33]一項研究表明免疫系統(tǒng)的年齡相關(guān)變化可能會影響轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者對抗PD-1 治療的反應(yīng)，高齡與低比例的幼稚CD8 + T細胞存在顯著相關(guān)性。同樣在本項研究中年齡與BTC 免疫治療患者的PFS 顯著相關(guān)，隨著年齡增大，患者表現(xiàn)出更短PFS。

本研究存在一定的局限性：1)當前研究為單中心、小樣本的回顧性研究，證據(jù)級別不高并且可能存在偏倚。因此，這些初步結(jié)果有必要進行前瞻性研究進一步驗證。2)缺乏未接受PD-1 抑制劑治療患者的對照組。3)OS 同樣是研究的重要觀察指標，但由于研究過程中患者失訪以及疾病進展后更換治療措施，導(dǎo)致OS 的數(shù)據(jù)刪失比重過大，未將其納入結(jié)局指標。

總之，我們的研究表明治療前NLR 和PLR是BTC 患者PD-1 抑制劑治療預(yù)后的獨立預(yù)測因子，聯(lián)合指標CNP 可以將PD-1 治療預(yù)后更好的患者篩選出來。這些炎癥指標可以幫助臨床醫(yī)生在治療開始前識別更有可能從抗PD-1 治療中受益的BTC 患者。此外，作為常規(guī)性質(zhì)的評估，這些標志物可以更容易地應(yīng)用到臨床實踐中。