不同提取方式對冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的影響

胡 楊，李先芝，2*，石 豪，劉 洋，毛瓊麗，嚴 玲

(1.勁牌有限公司，湖北 大冶 435112；2.中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 大冶 435112 )

冬葵果為錦葵科植物冬葵(MalvaverticillataL.)的干燥成熟果實，一般于夏、秋季節果實成熟時采收，除去雜質，陰干，冬葵果藥材外表黃綠色或黃棕色，具有清熱利尿、消腫之功效[1]，該藥作為蒙古族常用藥，在我國具有悠久應用歷史。有研究表明，冬葵果中含有揮發油、多糖、酚酸、黃酮等有效成分[2-5]，而咖啡酸、阿魏酸是冬葵果中主要的酚酸類化合物。現代藥理學研究表明，咖啡酸、阿魏酸等酚酸類具有抗病毒、抗氧化、調節免疫力、護肝、抗癌等生物活性[6-13]，因此對冬葵果進行深加工，并對其有效藥用成分進行提取，具有廣闊的開發利用前景。

《中國藥典》是通過測定冬葵果中的總酚酸含量對其質量進行控制，但只介紹了紫外分光光度法，而應用高效液相色譜法同時測定冬葵果中的咖啡酸、阿魏酸的含量未見報道。本研究以冬葵果為原料，分別采用水煮法、醇提法、超聲提取法、索氏提取法等幾種常見提取方法對冬葵果中咖啡酸、阿魏酸進行提取，并以HPLC法對其進行含量測定，以期找到一種簡單且有效的提取方法，為冬葵果的進一步開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀(賽默飛公司，uLtiMate 3000，美國)；電子分析天平(賽多利斯SQP，德國)；數控超聲波清洗儀(上海科導超聲儀器有限公司，中國)；PURELAB-超純水儀(PURELAB classic UV，英國)；數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司，中國)；索氏提取器(SXT-06，上海洪紀儀器設備有限公司，中國)。

1.1.2 試劑 乙腈(HPLC級，美國費希爾公司)；磷酸(HPLC級，國藥集團有限公司)；乙醇(國藥集團有限公司，分析純)；水為超純水；其他試劑均為分析純。對照品：咖啡酸(批號：110885-201703，純度99.7%，中國藥品檢定研究院)，阿魏酸(批號：110773-201313，純度99.6%，中國藥品檢定研究院)。冬葵果樣品由勁牌持正堂藥業有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 水煮法 準確稱取冬葵果粉末0.5 g置錐形瓶中，精密加入蒸餾水20 mL，于80 ℃條件下回流1 h，放冷，用蒸餾水補足減失的重量，取少量過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.2.2 醇提法 準確稱取冬葵果粉末0.5 g置加熱回流裝置中，精密加入50%乙醇20 mL，于90 ℃條件下回流3 h，用50%乙醇補足減失的重量，取少量過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.2.3 超聲提取法 準確稱取冬葵果粉末0.5 g置錐形瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，在250 W、35 kHz、90 ℃條件下超聲30 min，用50%乙醇補足減失的重量，取少量過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.2.4 索氏提取法 準確稱取冬葵果粉末0.5 g置索氏提取裝置中，精密加入50%乙醇20 mL，于90 ℃條件下回流3 h，用50%乙醇補足減失的重量，取少量過0.45 μm微孔濾膜，即得。

1.2.5 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫見表1；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長325 nm。在此色譜條件下記錄色譜圖。

表1 冬葵果檢測流動相洗脫程序

2 結果與討論

2.1 水煮法條件的確定

因咖啡酸與阿魏酸均溶于熱水，故本研究對時間和溫度進行優化，選取不同的提取時間和提取溫度依次進行試驗。結果發現，當溫度上升時，咖啡酸、阿魏酸含量也隨之增加，但當溫度相同時，隨著時間的延長咖啡酸的含量逐漸降低，而阿魏酸含量逐漸增加。這可能是由于咖啡酸結構中含有不飽和雙鍵，在水煮條件下容易被氧化，而隨著時間的延長冬葵果粉與水分子間的吸附作用被破壞，阿魏酸被釋放出來[14-15]。綜合考慮，選擇編號2，提取溫度為80 ℃、提取時間為1 h，可達到綜合較優的效果。見表2、圖1。

2.2 醇提法條件的確定

由于咖啡酸和阿魏酸含有較多的親水基，故其可溶于水或者親水的有機試劑如乙醇。而乙醇是較常用的提取溶劑，故醇提法選擇乙醇作為提取溶劑。為了達到最佳的提取效果，本研究采用正交試驗對乙醇比例、提取溫度和提取時間3個因素分別進行優化，每個因素設3個水平，見表3。通過正交試驗結果分析，結果顯示提取溶劑乙醇的比例對咖啡酸和阿魏酸的提取效果影響最大，R分別為0.221 2、0.044 7；而提取時間對提取效果的影響最小，R分別為0.057 4、0.016 2。綜上，編號3的提取效果最佳，咖啡酸和阿魏酸含量分別為0.193 6 mg/g、0.029 4 mg/g。故最終選擇的提取條件為乙醇比例為50%、提取時間為3 h、提取溫度為90 ℃。見表3、表4。

2.3 不同提取方式對咖啡酸、阿魏酸含量的影響

在確定了提取溶劑的比例、提取時間、提取溫度的情況下，將不同提取方式對冬葵果中咖啡酸、阿魏酸的提取效果進行了比較，結果見表5。由表5可知，醇提法相對于其他方法而言具有較大的優勢。因此，選擇醇提法作為最終提取方法。

表2 不同提取條件對冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的影響

圖1 同一溫度不同時間對冬葵果中 咖啡酸、阿魏酸含量的影響

表3 試驗因素水平

2.4 方法學考察

2.4.1 對照品溶液的制備 精確稱取咖啡酸8.33 mg、阿魏酸5.98 mg至20 mL的容量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，即得咖啡酸濃度為415.250 5 mg/L、阿魏酸濃度為297.804 mg/L的混合對照品母液。

2.4.2 供試品溶液的制備 準確稱取冬葵果粉末0.5 g置加熱回流裝置中，精密加入50%乙醇20 mL，于90 ℃條件下回流3 h，用50%乙醇補足減失的重量，取少量過0.45 μm微孔濾膜，即得。

表4 正交試驗結果

表5 不同提取方式對冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的影響比較 (mg/g)

2.4.3 線性關系考察 將混合對照品溶液母液稀釋成5個不同濃度水平的對照品混合溶液，精密吸取5個不同濃度的對照品混合溶液10 μL，注入液相色譜儀，得到各濃度的色譜峰的峰面積，以濃度為橫坐標，相對應的色譜峰面積為縱坐標建立標準曲線，得出線性關系及范圍。結果見表6。

表6 線性范圍

2.4.4 精密度試驗 取同一冬葵果樣品，按照“2.4.1”項下供試品溶液制備方法制備供試品，按“1.2.5”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，咖啡酸、阿魏酸峰面積的RSD分別為0.42%、1.12%(n=6)，表明該儀器精密度良好。

2.4.5 重復性試驗 取同一冬葵果樣品6份，按照“2.4.1”項下供試品溶液制備方法制備供試品，按“1.2.5”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，咖啡酸、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.61%、1.33%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.4.6 穩定性試驗 取同一冬葵果樣品，按照“2.4.1”項下供試品溶液制備方法制備供試品，按“1.2.5”項下色譜條件分別在0、2、5、9、13、18 h進樣，記錄峰面積。結果顯示，咖啡酸、阿魏酸峰面積的RSD分別為0.42%、0.48%(n=6)，表明供試品溶液在室溫下放置18 h穩定性良好。

2.4.7 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的冬葵果樣品0.25 g至加熱回流裝置中，共9份。分別按照冬葵果中咖啡酸、阿魏酸含量的50%、100%、150%共3個水平加入對照品適量，按“1.2.5”項下色譜條件進行測定，咖啡酸、阿魏酸加樣回收率結果見表7。咖啡酸與阿魏酸的加樣回收率在93.48%～100.95%之間，RSD值小于3%。

表7 冬葵果中咖啡酸、阿魏酸的加樣回收率 (n=9)

3 結論

本研究探討不同提取方法對冬葵果中咖啡酸和阿魏酸含量的影響，結果發現采用醇提法時，咖啡酸與阿魏酸的含量最高，分別達到0.193 6 mg/g、0.029 4 mg/g；其最佳提取條件為：乙醇比例50%，提取溫度90 ℃，提取時間4 h。本研究通過HPLC法同時測定冬葵果樣品中咖啡酸和阿魏酸的含量，試驗結果表明，該方法操作簡單、重復性好、準確度高，可用于冬葵果藥材中咖啡酸和阿魏酸含量的檢測及質量監控。