類風濕關節炎濾泡調節性T細胞與血清免疫球蛋白及疾病活動度相關性研究〔1〕

高強，王佩佩，牛騰耀，王霞，詹靜慧，張艷麗

(寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏 銀川 750004)

類風濕關節炎(RA)是一種以關節滑膜的慢性炎癥為基本病理改變的全身性自身免疫疾病，臨床上多表現為對稱性、持續性、進行性的小關節受累，并最終導致關節畸形和功能喪失[1]。28關節疾病活動性評分(DAS28)以28個關節[包括雙手近端指關節(10個)、雙手掌指關節(10個)、雙腕關節(2個)、雙肘關節(2個)、雙肩關節(2個)、雙膝關節(2個)]計分，通過測量患者壓痛關節數、腫脹關節數及血沉(ESR)來計算，可以較好地反映RA患者的疾病活動度[2]。同時，RA患者血清中血清免疫球蛋白(Ig)M，IgG，IgA水平均高于正常人，提示體液免疫功能紊亂在RA的發生發展中起到了重要作用[3]。這些免疫球蛋白多為自身抗體，如類風濕因子(RF)等，會導致RA患者出現關節腫痛、骨質破壞，甚至發生關節畸形[4]。濾泡調節性T細胞(Tfr)是一種定位于淋巴濾泡生發中心(GC)的CD4+T細胞，主要通過抑制濾泡輔助性T(Tfh)細胞以及GC中B細胞的功能來發揮其負向調節體液免疫的作用，從而維持機體免疫穩態[5]。RA目前的主要治療方法是長期服用抗風濕藥物，尚無根治辦法。已經有研究[6-9]顯示Tfr細胞的數目和功能異常與多種自身免疫性疾病有關[6]。本實驗擬通過研究RA患者外周血Tfr細胞與血清免疫球蛋白水平及疾病活動度的相關性，討論Tfr細胞在RA中發揮的作用，為臨床上干預RA的發展提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2020年7月—2021年7月30 例在寧夏醫科大學總醫院風濕免疫科就診的RA患者，均符合2010年美國風濕病學會(ACR)/歐洲風濕病聯盟(EULAR)制定的診療標準[10]。RA診斷標準：就診前6個月不合并其他感染性疾病和自身免疫病；就診前未服用過激素及抗風濕類藥物。患者年齡(53.7±11.9) 歲；男15 例，女15 例；檢測血清IgM為(1.7±1.2) g/L，IgG為(17.3±6.4) g/L，IgA為(3.4±1.5) g/L。同時納入30名健康體檢者為對照組。納入標準：近期無感染、發熱；無自身免疫病及腫瘤、艾滋病、結核等慢性感染性疾病病史。健康對照組年齡(49.6±10.6) 歲，男15 例，女15 例。

Accuri C6型流式細胞儀購自美國BD公司；人外周血淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；多甲藻黃素-葉綠素蛋白-花青素5.5(PerCP-Cy5.5)標記的抗人CD4單克隆抗體(CD4-PerCP-Cy5.5)、Alexa Fluor 488(AF488)標記的抗人CXC趨化因子受體5(CXCR5)單克隆抗體(CXCR5-AF488)購自美國BD公司；別藻藍蛋白(APC)標記的抗人叉頭盒P3(FOXP3)單克隆抗體(FOXP3-APC)購自美國eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 RA患者分組

根據DAS28值，將RA患者分為高度活動組(DAS28>5.1，16 例)和輕中度活動組(DAS28≤5.1，14 例)[11]。

1.2.2 標本采集與處理

采集RA患者和健康對照者的新鮮全血，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝。用等體積磷酸緩沖液(PBS)稀釋全血后，加入人外周血淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMC)，再用PBS緩沖液洗滌。

1.2.3 流式細胞術檢測外周血Tfr細胞比例

取剛分離的PBMC 2×106個，順序加入CD4-PerCP-Cy5.5，CXCR5-AF488和FOXP3-APC溶液各3 μL，在室溫且避光的條件下孵育30 min后，用PBS緩沖液洗滌兩次，上機檢測。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 RA組和健康對照組外周血Tfr細胞比例比較

根據流式細胞術結果，外周血中的Tfr細胞比例RA組為(0.77±0.07)%，健康對照組為(1.27±1.66)%，RA組與健康對照組相比明顯下降，差異有統計學意義(t=-15.139，P<0.05，見圖1)。

(a)：兩組外周血Tfr細胞比例流式細胞術檢測；(b)：兩組外周血Tfr細胞比例的半定量分析，與健康對照組相比較，P<0.05

2.2 RA組高度活動組與輕中度活動組Tfr細胞比例比較

RA組中，Tfr細胞比例高度活動度組為(0.74±0.44)%，輕中度活動組為(0.81±0.74)%，高度活動度組低于輕中度活動組，差異有統計學意義(t=-3.523，P<0.05)。

2.3 RA患者外周血Tfr細胞比例與血清免疫球蛋白水平的相關性

Spearman相關性分析結果顯示，RA患者外周血Tfr細胞比例與血清IgM，IgG，IgA水平均呈負相關(r=-0.4876，r=-0.3961，r=-0.4053，見圖2)。

(a)：Tfr細胞比例與血清IgM水平相關性；(b)：Tfr細胞比例與血清IgG水平相關性；(c)：Tfr細胞比例與血清IgA水平相關性

3 討 論

RA發病機制復雜，病程遷延不愈，以關節、滑膜的慢性炎癥為主要特征，發生軟骨和骨的損害，而且還伴隨全身多系統癥狀，包括心血管系統、呼吸系統、神經系統、血液系統等[12]。本研究發現，RA患者外周血Tfr細胞比例相比于健康對照組顯著下降；在RA組中，高度活動組Tfr細胞比例低于輕中度活動組，且外周血Tfr細胞比例與血清免疫球蛋白水平呈負相關，說明Tfr細胞數量減少在RA大量自身抗體的產生及疾病的發展中起到了重要作用。自身抗體是多種自身免疫性疾病的病理產物和血清學標志物。自身抗體的產生可導致免疫復合物在各臟器中沉積，激活補體系統和其他免疫細胞進而引起全身不可控的自身免疫反應，造成嚴重的組織損傷。此外，自身抗體還可以通過抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)直接損傷靶組織，自身抗體水平越高，疾病的癥狀往往越嚴重[13]。研究[14]表明，Tfr細胞的數量減少或功能障礙導致的過度Tfh細胞應答和GC反應會刺激自身抗體的產生。Tfh細胞和Tfr細胞均為CD4+T細胞亞群，二者關系密切，在表型上有許多類似之處，均表達CXCR5、B細胞淋巴瘤因子-6(Bcl-6)、誘導性共刺激分子(ICOS)、程序性死亡蛋白-1(PD-1)。但是由于Tfr細胞起源于外周的自然調節性T(nTreg)細胞，所以其表型更接近于nTreg細胞。因此，Tfr細胞除表達上述的分子以外，還表達FOXP3、糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR)、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)等[15]。Tfh細胞可以分泌CXC趨化因子配體13(CXCL13)，其與B細胞表面及自身表達的受體CXCR5結合，招募B細胞和自身遷移至GC中，并通過其表面表達的多種信號分子促進GC中B細胞的成熟、活化以及抗體的產生[16]。研究[17]表明，體液免疫中B細胞的數量和抗原親和力決定了其接受Tfh細胞輔助的能力，而自身反應性B細胞可能會過多地獲得Tfh細胞輔助，逃脫免疫耐受，進而導致自身抗體的產生。Tfr細胞則在GC反應的負向調控中發揮著重要的作用，其通過抑制Tfh細胞和GC的B細胞來抑制體液免疫。Tfr發揮作用主要是通過抑制B細胞活化的下游效應，包括免疫球蛋白類別轉換(CSR)和體細胞高頻突變等[18-21]。Tfr發揮其效應依賴多種途徑，例如，Tfr細胞可以通過其表面表達的抑制性分子CTLA-4與B細胞以及Tfh細胞表面的受體結合，直接抑制B細胞和Tfh細胞的發育；此外，Tfr細胞還抑制白細胞介素-4(IL-4)的分泌，而IL-4則在GC反應和抗體產生的過程中發揮著重要作用。另有，Tfr細胞還可通過分泌抑制性的細胞因子如IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)等抑制GC反應和抗體的產生[22-23]。因此，Tfr細胞的數量減少很可能引起體液免疫功能紊亂，導致大量自身抗體的產生，是RA重要的發病基礎[24-25]，并且可能與疾病的活動度有關。

綜上所述，Tfr細胞數量減少，可能是引起RA大量自身抗體產生的一個重要危險因素，并且與疾病的發展有關。其機制可能是Tfr細胞通過抑制Tfh細胞和GC中B細胞的功能來發揮負向調節體液免疫功能的作用。但其發揮作用的信號通路和具體分子機制仍有待于進一步研究證實，以期具體闡明Tfr細胞在RA中的作用。