兩種禽白血病診斷試劑的比對(duì)研究

姜同泉 朱紹輝 齊艷君 行鵬 王小偉 柏程昊 肖發(fā)沂

摘 要：本研究同時(shí)采用禽白血病ELISA檢測(cè)試劑盒和禽白血病乳膠微球檢測(cè)試紙條對(duì)已確診的278份禽白血病臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種診斷試劑檢測(cè)結(jié)果的差異。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，禽白血病ELISA檢測(cè)試劑盒敏感性為94.74%，特異性為99.61%，與確診結(jié)果間的Kappa值為0.94;禽白血病乳膠微球檢測(cè)試紙條敏感性為94.74%，特異性為100%，與確診結(jié)果間的Kappa值為0.97，兩種診斷試劑的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果均一致。試驗(yàn)結(jié)果證明，禽白血病乳膠微球檢測(cè)試紙條和禽白血病ELISA檢測(cè)試劑盒都能滿足禽白血病的檢測(cè)需求;由于禽白血病乳膠微球檢測(cè)試紙條的經(jīng)濟(jì)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和操作的便捷性，更適用于禽白血病凈化。

關(guān)鍵詞：禽白血病;ELISA檢測(cè)試劑盒;試紙條;比對(duì)

中圖分類號(hào)：S858.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1673-1085（2022）05-0005-05

禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的一種免疫抑制性腫瘤病[1-3]，依據(jù)病毒囊膜糖蛋白的抗原性差異、病毒干擾試驗(yàn)、宿主范圍和基因組的特性，禽白血病病毒已分類至10個(gè)亞群，命名為A～J亞群[4]。ALV的自然宿主主要是雞，以A、B、C、D、E和J亞群為主，感染率高，發(fā)病率低，但雞群感染 ALV 后會(huì)造成生產(chǎn)性能下降，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病之一[5]。

目前，該病還沒有切實(shí)可行的預(yù)防和治療方法，也沒有有效的疫苗，實(shí)施種禽ALV凈化是控制該病的最根本方法。疫病凈化離不開抗原抗體的檢測(cè)，因此，控制禽白血病的最佳方式是采用準(zhǔn)確、快速、適用的檢測(cè)方法來檢測(cè)和篩選感染雞群，從而培育無ALV感染的種雞群。目前，禽白血病的檢測(cè)方法較多，臨床實(shí)踐中應(yīng)用比較多的主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫層析試紙條、PCR等，各種方法有其自身的優(yōu)點(diǎn)和劣勢(shì)[6-7]。ELISA法因其具有敏感高、簡(jiǎn)便快捷、適用于大規(guī)模檢測(cè)的特點(diǎn)備受青睞。近年來，乳膠微球檢測(cè)試紙條也因其快速、便捷、成本低、較膠體金檢測(cè)試紙條靈敏度高等優(yōu)勢(shì)受到廣大診斷研究和研發(fā)單位的關(guān)注，其靈敏性、特異性和可重復(fù)性決定了其最終應(yīng)用前景。本研究旨在通過3種商品化禽白血病ELISA檢測(cè)試劑盒與禽白血病乳膠微球檢測(cè)試紙條在檢測(cè)ALV方面的靈敏度和特異性[8-9]，比較兩種診斷試劑檢測(cè)結(jié)果的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

3種商品化禽白血病ELISA抗原檢測(cè)試劑盒均為商品化產(chǎn)品，禽白血病乳膠微球檢測(cè)試紙條為山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院研制和提供;278份臨床樣品（包括68份抗凝血樣品、210份血清樣品）均為臨床采集的病料。

1.2 方法

1.2.1 臨床樣品的確診 采用GB/T 26436-2010禽白血病診斷技術(shù)中規(guī)定的熒光定量PCR方法操作規(guī)程對(duì)278份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)和判定結(jié)果。

1.2.2 兩種診斷試劑敏感性和特異性比對(duì) 將1.2.1中確診的278份臨床樣品同時(shí)采用禽白血病乳膠微球檢測(cè)試紙條和禽白血病ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)、比對(duì)。均按照各自的說明書操作和判定結(jié)果，并按公式：敏感性 Se=a/（a+c），特異性Sp=d/（b+d）[9-11]，假陽性率=b/（b+d），假陰性率=c/（a+c），計(jì)算兩種檢測(cè)試劑的敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率（表1）。按照公式 Kappa=2（ad-bc）/（p1q2+p2q1），計(jì)算兩種試劑與SAT結(jié)果間的Kappa值，比較其符合程度。Kappa值為0.81～1.00時(shí)，判定兩種方法完全符合;為0.61～0.80時(shí)，判定兩種方法高度符合;為0.41～0.60時(shí)，判定兩種方法中度符合;為0.21～0.40時(shí)，判定兩種方法比較符合;0.20以下為輕度符合;0以下為不符合[12]。

1.2.3 兩種診斷試劑重復(fù)性比對(duì) 隨機(jī)選取經(jīng)熒光定量PCR方法確診的禽白血病樣品（編號(hào)P1～P10）和陰性樣品（編號(hào)N1～N10）各10份，采用禽白血病乳膠微球檢測(cè)試紙條和禽白血病ELISA檢測(cè)試劑盒同時(shí)進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，比對(duì)兩者的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣品的確診結(jié)果

采用GB/T 26436-2010禽白血病診斷技術(shù)中規(guī)定的熒光定量PCR方法操作規(guī)程對(duì)278份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)和判定結(jié)果。結(jié)果確診19份禽白血病陽性樣品（包括10份抗凝血樣品，9份血清樣品）和259份禽白血病陰性樣品（包括59份抗凝血樣品和200份血清樣品）。

2.2 敏感性、特異性比對(duì)

采用禽白血病乳膠微球檢測(cè)試紙條檢測(cè)2.1中已確診的278份臨床樣品，共檢出18份陽性樣品、259份陰性樣品，敏感性為94.74%（18/19），特異性為100%（259/259），假陽性率為0（0/19），假陰性率為5.26%（1/19），與熒光PCR方法的Kappa值為0.97;采用禽白血病ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)2.1中已確診的278份臨床樣品，共檢出18份陽性樣品、258份陰性樣品，敏感性為94.74%（18/19），特異性為99.61%（258/259），假陽性率為0.39%（1/259），假陰性率為5.26%（1/19），與熒光PCR方法的Kappa值為0.94，如表2所示。

2.3 重復(fù)性比對(duì)

隨機(jī)選取確診的禽白血病樣品（編號(hào)P1～P3）和陰性樣品（編號(hào)N1～N3）各5次，采用禽白血病乳膠微球檢測(cè)試紙條和禽白血病ELISA檢測(cè)試劑盒同時(shí)進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，比對(duì)兩者的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，兩種診斷試劑的檢測(cè)結(jié)果均一致，即兩種診斷試劑的重復(fù)性良好，如表3所示。

3 討論

ALV不同亞群能夠誘發(fā)不同種類的白血病，是雞腫瘤性疾病最主要的病原體[13]，也是目前已知的唯一擁有外源性和內(nèi)源性重復(fù)活性的逆轉(zhuǎn)錄病毒[14]，是最先被人們關(guān)注并研究的禽的三大腫瘤性疾病之一。雞感染ALV后的診斷可以根據(jù)流行病學(xué)及器官和組織的典型病理學(xué)變化進(jìn)行初步判定，實(shí)驗(yàn)室病原的檢測(cè)作為確診依據(jù)。實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括病毒的分離鑒定、間接免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、核酸檢測(cè)、膠體金試紙條等[15]。1FAB15F2-9EBA-480A-9E5E-ABB40618407E

ALV分離鑒定可采用的樣品豐富，包括全血、血清、血漿、泄殖腔拭子及組織器官等，方法可靠，特異性高，能夠排除內(nèi)源性ALV的干擾，是國(guó)際公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)，但病毒分離后需要接種于細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，操作較繁瑣，技術(shù)性較高，全過程耗時(shí)較長(zhǎng)，大約需要10 d時(shí)間，不適用于大規(guī)模的快速檢測(cè)[16]。間接免疫熒光也具有較高的靈敏度和特異性，然而對(duì)于間接免疫熒光的結(jié)果判定存在一定的主觀性，如一些非特異性或者微量熒光的判定結(jié)果常常因人而異[15]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和核酸檢測(cè)目前在臨床中應(yīng)用較多，具有較強(qiáng)的特異性和靈敏度，但是易出現(xiàn)內(nèi)源性ALV假陽性，并且對(duì)設(shè)備要求高，需要與檢測(cè)相適應(yīng)的操作環(huán)境和人員，在基層診斷中使用難度較大。禽白血病基層的臨床診斷需要一種特異性強(qiáng)、敏感度高、在操作上簡(jiǎn)便快捷以及對(duì)人員、設(shè)備、環(huán)境等要求低、更適用基層診斷的方法，而免疫層析試紙條具備便捷、快速、成本低的特點(diǎn)，且隨著技術(shù)的進(jìn)步，特異性和敏感性不斷提高，在動(dòng)物疫病檢測(cè)中應(yīng)用廣泛[17-18]，日益受到基層診斷工作者的接受。

目前，市面上只有膠體金檢測(cè)試紙條，但膠體金檢測(cè)試紙條存在靈敏度偏低、穩(wěn)定性較差的缺點(diǎn)，而乳膠微球檢測(cè)試紙條由于采用的標(biāo)記載體是乳膠微球，這就克服了膠體金燒制過程中容易出現(xiàn)的顆粒不均勻、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、均一性差的問題，并且微球親水表面且基團(tuán)含量豐富，使得蛋白結(jié)合能力更高、靈敏度更高，是膠體金的理想替代品。從本研究結(jié)果也可以看出，禽白血病乳膠微球檢測(cè)試紙條與禽白血病ELISA抗原檢測(cè)試劑盒敏感性、特異性和重復(fù)性均較好，均可以用于養(yǎng)禽場(chǎng)禽白血病的凈化，但乳膠微球檢測(cè)試紙條因其使用便捷、快速、成本低廉，因而更適于基層養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)用。

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