SD大鼠原代海馬神經元的一種優化培養方法

強婷婷，胡憲文，張 麗

(安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉與圍術期醫學科，麻醉與圍術期醫學安徽普通高校重點實驗室，安徽 合肥 230601)

體外培養的海馬神經元是研究中樞系統神經發育及神經精神疾病發病機制的重要細胞模型[1]，該模型具有培養條件易控、機體復雜因素干擾少、結果易分析等優勢。目前應用比較廣泛的培養方法是利用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM/F12培養基進行神經元培養[2-4]。但是，利用10% FBS培養出來的海馬神經元混雜了很多膠質細胞，常需要加入有絲分裂抑制劑如阿糖胞苷、5-氟-2′脫氧尿苷(5-Fluoro-2-deoxyuridine，FUDR)[5-6]抑制膠質細胞的生長。然而，有絲分裂抑制劑的使用在一定程度上會抑制神經元生長和分化。因此，本研究提出一種全程無血清的培養方法，并比較無血清培養、FBS培養和FBS+FUDR培養這3種方法培養出來的神經元的生長狀態和純度，為培養出活力好、純度高的原代海馬神經元提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 孕(18±1)d SD大鼠由安徽醫科大學動物實驗中心提供，生產許可證編號：SCXK(皖)2017-001。

1.1.2主要器械與試劑耗材 小動物手術器械一套，不同規格的玻璃皿一套，高壓蒸汽滅菌及烘干后使用。60 mm培養皿、24孔板、96孔板(CORNING公司，美國)；DMEM/F12培養基、谷胱甘肽(Glutamax)、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-EDTA、B-27、Neurobasal培養基(Gibco公司，美國)；5-氟-2′脫氧尿苷、多聚-L-賴氨酸(Poly-L-lysine，PLL)、巰基乙醇、腐胺、硒、胰島素、黃體酮(Sigma公司，美國)；FBS(Lonsera公司，烏拉圭)；葡萄糖、抗熒光淬滅封片液、CCK-8檢測試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒(碧云天生物技術公司，北京)；正常山羊血清、TritonX-100(索萊寶科技有限公司，北京)；微管結合蛋白2(MAP2)抗體、神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)小鼠單克隆抗體(CST公司，美國)；Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG(Thermo公司，美國)。

1.1.3主要儀器設備 CO2細胞培養箱、多功能酶標儀、超凈工作臺(Thermo公司，美國)，倒置相差熒光顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1溶液配制 (1)PLL工作液：25 mg PLL凍干粉劑溶于滅菌后的超純水中，配成0.1 g·L-1，經0.22 μm無菌濾器過濾后分裝備用。(2)FUDR：100 mg溶于100 mL無菌超純水中，配成1 g·L-1，經0.22 μm無菌濾器過濾后分裝，避光保存。(3)激素混合劑(hormone cocktail，HC)4 mL：25%胰島素(5 kg·L-1)+0.125%黃體酮(1.256 g·L-1)+12.5%腐胺(32.2 g·L-1)+0.25%硒(0.52 g·L-1)+62.125%純水。(4)Neurobasal細胞種植液100 mL：94.5% Neurobasal+1%青-鏈霉素+1%Glutamax+1%葡萄糖(30%)+2%B-27+0.4% HC+0.1% β-巰基乙醇。(5)DMEM/F12細胞種植液100 mL：88% DMEM/F12+10% FBS+1%青-鏈霉素+1% Glutamax。(6)Neurobasal細胞維持液100 mL：96% Neurobasal+2% B-27+1%青-鏈霉素+1% Glutamax。

1.2.2實驗分組 無血清培養組(Serum-free組)：Neurobasal細胞種植液，12 h后換成Neurobasal細胞維持液；胎牛血清培養組(FBS組)：DMEM/F12細胞種植液，12 h后換成Neurobasal細胞維持液；胎牛血清+5-氟-2′脫氧尿苷培養組(FBS+FUDR組)：DMEM/F12細胞種植液，12 h后換成Neurobasal細胞維持液，培養至d 3時加入50 μmol·L-1FUDR。

1.2.3細胞培養皿及培養板準備 眼科鑷紫外線消毒以后將細胞培養專用爬片(直徑14 mm)放置于24孔板中，按照200 μL·cm-2的劑量滴加PLL。若直接將細胞種在60 mm培養皿或者96孔板中則滴加PLL為150 μL·cm-2。包被5 min后用無菌的超純水清洗3遍，超凈臺晾干后待用。

1.2.4SD大鼠胎鼠海馬神經元培養 (1)取材：取孕(18±1)d SD大鼠，根據文獻[7]方法，七氟烷麻醉孕鼠，用75%酒精消毒孕鼠腹部，“V”字形剪開腹部，快速取出胚胎置于培養皿內，然后迅速將胎鼠斷頭取腦，放入裝有預冷的PBS緩沖液的培養皿中，解剖顯微鏡下分離海馬組織，仔細剝離血管膜后將完整的海馬組織置于PBS緩沖液中。(2)消化及離心：在生物安全柜中將海馬組織轉移到15 mL離心管中，棄掉上層的PBS，然后加入2 mL 0.25%胰酶(37 ℃預熱)消化液，用1 mL移液槍吹散組織后再把組織胰酶混合液轉移到60 mm培養皿，放在37 ℃培養箱內消化10 min。消化結束后用10% FBS等體積中和胰酶(即為中和液)，用1 mL槍頭輕輕吹打30次，然后等體積分成兩部分，將含海馬細胞的兩份中和液置于離心機中，1 200 r·min-1，離心5 min，棄去中和液，分別加入適量Neurobasal細胞種植液和DMEM/F12細胞種植液，輕柔吹打1 min，重新懸浮細胞并使之變成單細胞懸液。(3)細胞計數及接種：取10 μL單細胞懸液，滴加在紅細胞計數板上計數，調整接種密度為(2～3)×108個·L-1，14 mm細胞爬片種植400 μL細胞懸液，60 mm培養皿種植3 mL細胞懸液，96孔板種植150 μL細胞懸液，放入CO2細胞培養箱中培養。(4)換液及純化：培養12 h后，全量換液為Neurobasal細胞維持液。培養d 3后，半量換液，FUDR培養組加入50 μmol·L-1FUDR。每隔3 d更換一次細胞培養液，半量換液。

1.2.5形態學觀察 分別在d 1、d 3、d 5、d 7、d 9、d 13、d 17、d 21時間點于倒置顯微鏡明場下觀察海馬神經元的細胞形態并拍照。

1.2.6CCK-8檢測細胞活力 觀察1～21 d 3組海馬神經元細胞的活力，每組設10個復孔。將細胞懸液調整密度后種植于96孔板內，每孔100 μL細胞懸液，約3萬個細胞。于不同時間點棄去96孔板中的培養基，重新加入Neurobasal細胞維持液，100 μL/孔。再加入10 μL/孔CCK-8溶液，放入CO2細胞培養箱中孵育2 h。酶標儀測定450 nm處的吸光度(OD值)。

1.2.7TUNEL染色檢測細胞凋亡 培養至d 7的神經元，棄去培養基，加入4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS洗1次，再加入0.3% Triton X-100室溫通透細胞5 min，加入50 μL/孔TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次，滴加抗熒光淬滅封片液，置于熒光顯微鏡下觀察，每組選取5個視野計算細胞凋亡比例。

1.2.8免疫熒光檢測細胞純度 培養至d 7的神經元，棄去培養基，加入4%多聚甲醛，室溫下固定細胞15 min，PBS洗3遍，每次5 min。每孔加入0.3% TritonX-100，室溫下通透10 min，PBS漂洗3次。每孔加入5%正常山羊血清，37 ℃下封閉40 min。棄去封閉緩沖液，然后每孔加入稀釋后的一抗(稀釋比MAP2 1 ∶50，GFAP 1 ∶300)，4 ℃過夜，PBS洗3次。用眼科鑷取出細胞爬片置于24孔板蓋子上，滴加混有山羊抗兔、山羊抗鼠的二抗(稀釋比均為1 ∶1 000)，室溫避光孵育1 h，PBS洗3次。在玻片上滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，用鑷子夾起爬片反扣于載玻片上，避光存放于濕盒中。在熒光顯微鏡下觀察并拍照。紅色熒光為MAP2陽性細胞(海馬神經元)，綠色熒光為GFAP陽性細胞(膠質細胞)，藍色熒光為DAPI染色(細胞核)。神經元純度計算方法：MAP2陽性細胞數/DAPI核染色細胞數×100%。每次細胞計數時隨機選取5個視野(顯微鏡下100倍視野范圍)，取平均值。

2 結果

2.1 原代海馬神經元的形態學特點初培養時，細胞密度均勻大小一致，懸浮在培養基中，外觀呈圓球狀，胞體透亮。培養至5 h后，絕大部分細胞已貼壁并且分布均勻，細胞呈類球形，略不規則，胞體透亮度明顯減低，稍有立體感，其中極少數細胞開始長出軸突和樹突。培養至24 h后，細胞完全貼壁，大部分細胞長出突起，多為雙極和多極細胞。此時細胞胞體呈類球形、橢圓形、漏斗形，胞體周圍出現光暈，細胞立體感增強。培養至d 3后，細胞胞體增大，突起增多變長甚至出現明顯分支。海馬神經元細胞開始出現聚集生長現象。培養至d 5后，細胞進一步聚集生長，并且細胞之間突起交織成網狀。培養至d 7～9，神經元成熟，胞體飽滿且周圍存在光暈，細胞突起形成豐富致密的網絡，但難以辨認突起起源。培養至d 13突起形成的網絡密集且粗壯，大部分細胞內部出現空泡。培養至d 17～21，細胞明顯開始衰老，部分胞體皺縮變小，甚至裂解死亡(Fig 1)。

Fig 1 The growth status of primary SD rat hippocampal neurons at different culture time points (Scale bar=50 μm)

2.2 不同培養方法培養時的海馬細胞生長曲線如Fig 2所示，比較3種培養方式下海馬神經元在d 1～21各個時間點的細胞活力。與FBS組相比，Serum-free組在d 8～21時細胞活力較高，表明無血清培養方法培養出來的海馬神經元更加穩定，差異有統計學意義(P<0.05，Fig 2)。FBS+FUDR組在細胞培養至d 3時加入FUDR，與FBS組相比，加入FUDR 48 h以后細胞活力明顯降低(P<0.05，Fig 2)，并且d 5～21的神經元的細胞活力一直低于FBS組(P<0.05，Fig 2)。

Fig 2 The continuous growth curve of hippocampal neurons detected by CCK-8

2.3 細胞凋亡比例如圖3所示，FBS+FUDR組與FBS組相比，細胞凋亡比例增加，表明FUDR可以促進細胞凋亡(P<0.05，Fig 3)。Serum-free組與FBS組相比，細胞凋亡率差異無統計學意義。

Fig 3 Cell apoptosis detected with TUNEL staining (400×，Scale bar=20 μm)

2.4 免疫熒光染色下神經元純度的鑒定相同種植密度下，Serum-free組MAP2陽性細胞比例高于FBS組(P<0.05，Fig 4，Tab 1)和FBS+FUDR組(P<0.05，Fig 4，Tab 1)，并且GFAP陽性細胞比例比FBS組和FBS+FUDR組低(P<0.05，Fig 4，Tab 1)。FBS+FUDR組與FBS組相比，GFAP陽性細胞比例降低(P<0.05，Fig 4，Tab 1)，表明細胞培養至d 3時加入FUDR可以抑制膠質細胞生長，提高神經元純度。

Tab 1 Purity of hippocampal neurons cultured by different methods

Fig 4 MAP2 and GFAP immunofluorescence co-staining (Merge2 group picture was×400，Scale bar=20 μm;the rest was×100，Scale bar=100 μm)

3 討論

海馬是神經認知領域研究的一個重要腦區。原代海馬神經元直接取材于動物的海馬組織，相對于細胞系能更好的模擬動物體內細胞，然而海馬神經元在體外不易存活，選擇合適的培養條件是神經元培養成功的關鍵因素之一。因此，如何獲得高純度、高活性、生存時間較長的原代海馬神經元，是一項值得深入研究的課題。本研究提出一種原代神經元培養的無血清的優化培養方案：以Neurobasal培養基為主，用B-27代替血清，Glutamax代替L-谷氨酰胺的優化配方來培養神經元。

為了促進神經元的貼壁和生長，以往的研究多在原代培養過程中使用了含有10%FBS的DMEM/F12培養基，但是FBS為神經元生長提供營養的同時也會刺激膠質細胞迅速生長[8]。本研究發現FBS組膠質細胞(GFAP陽性細胞)比例達到了10.4%，遠高于Serum-free組。在體外環境下，膠質細胞會釋放細胞毒性因子，促進神經細胞凋亡[5]。有研究提出在培養神經元過程中使用抗有絲分裂劑FUDR來降低膠質細胞比例，因為FUDR可通過減少非神經元細胞S期DNA合成的數量，來發揮抑制膠質細胞生長的作用[9-10]。然而本研究發現，在細胞生長至d 3后，即使按照FUDR的最低有效劑量(50 μmol·L-1)[11]使用也會給神經元帶來持續性損傷。經實驗發現，加入FUDR后神經元的細胞活力始終低于未加FUDR的FBS組。TUNEL染色結果也顯示，FBS+FUDR組的細胞凋亡率高于FBS組。因此，含有FBS的DMEM/F12培養基或者其中再加入了FUDR的培養基都不是最佳的原代神經元培養方案。

本研究采用無血清培養配方(Neurobasal+B-27)，其中B-27是非常理想的添加劑，能夠代替血清為神經細胞生長提供必需的神經因子。實驗結果顯示，無血清培養可以使神經元膠質細胞比例降低至3.5%，并且d 8～21培養的神經元活性顯著優于FBS組，證明無血清培養方案既能促進神經元的存活和生長，還能有效抑制非神經元的分裂增殖。神經元在培養12 h后(神經元完全貼壁而膠質細胞和細胞碎片未完全貼壁時)全部換液至Neurobasal維持液中生長，可以進一步降低膠質細胞比例。此外，優化方案中補充了少量細胞生長刺激物(包含硒、腐胺、胰島素、黃體酮)促進神經元生長，同時還添加了少量的 β-巰基乙醇能夠清除細胞生長過程中釋放的氧自由基，最大程度上降低血清減少帶來的不利影響。谷氨酰胺是細胞培養過程中產生能量和蛋白質合成所必需的氨基酸。然而，細胞培養液中的L-谷氨酰胺隨著時間的推移會自發降解生成氨，會影響蛋白質糖基化，降低蛋白質產量，降低細胞活力[12]。與L-谷氨酰胺不同，Glutamax添加劑不會自發分解，因此不會形成氨。相反，加入Glutamax后細胞會根據需要裂解二肽鍵以釋放L-谷氨酰胺[13]。因此無血清配方中使用Glutamax作為L-谷氨酰胺的直接替代品。這樣既可以防止氨的積累又在長期培養過程中維持了L-谷氨酰胺的新鮮供應。

綜上，從3種培養方案各自的SD大鼠胎鼠原代海馬神經元的培養結果來看，全程以Neurobasal+B-27培養基為主的無血清培養方法可以在短時間內獲得純度更高、活力更好的神經元，是建立體外海馬神經元原代培養模型的一種優化方法。