葛根素對棕櫚酸誘導胰島MIN6細胞損傷的保護作用

陳 銘，莫廣艷，葉 溪，徐小惠，高雨桐，張曉琳，吳婭妮，韋秀莎，黃仁彬，梁 韜

(1.廣西醫科大學藥學院，2.廣西壯族自治區人民醫院，3.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，4.廣西醫科大學附屬口腔醫院，5.廣西壯族自治區衛生健康委員會口腔感染性疾病防治重點實驗室，廣西 南寧 530021)

隨著人類生活水平的不斷提高，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)已經成為嚴重影響人類健康生活質量的公共衛生問題，而且T2DM的發病呈現逐年年輕化[1]。T2DM是一種病因復雜的慢性全身性疾病，以胰島素抵抗、血液中葡萄糖水平升高和胰島β細胞功能障礙為主要特征[2]。其中，肥胖是導致T2DM的主要影響因素之一，高水平的游離脂肪酸對胰島β細胞可產生明顯毒性作用，并可誘導機體發生胰島素抵抗。研究表明，長期暴露于高濃度的游離脂肪酸則可導致胰島β細胞功能受損，胰島素分泌絕對或相對不足，從而引發糖尿病[3-4]。因此，探討抑制游離脂肪酸誘導的胰島功能損傷和胰島β細胞凋亡的策略，對T2DM的防治具有非常重要的意義。

葛根素(puerarin，PR)是從豆科植物野葛PuerarinLobata(Wild) Ohwi根部中提取的異黃酮類生物活性成分。在我國已被廣泛應用于T2DM、糖尿病腎病、糖尿病心肌病等糖尿病并發癥的治療[5]。前期研究發現，葛根素可明顯改善鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病小鼠糖尿病前期狀態，改善胰腺超微組織損傷[6]。但目前尚未有相關文獻明確葛根素對胰島細胞的體外保護作用機制，因此，本研究將采用體外培養的小鼠胰島β細胞株(MIN6細胞)，觀察葛根素對棕櫚酸誘導的MIN6細胞損傷和凋亡的影響，并從NF-κB信號通路及凋亡相關因子的角度探究其可能機制。

1 材料

1.1 實驗細胞MIN6細胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號：CL-0674 。

1.2 藥品與試劑葛根素注射液(山東方明藥業集團股份有限公司，批號：H20033292)、棕櫚酸鈉(鯤創科技股份有限公司，批號：KCSJ002)、胎牛血清(Gemini公司，批號：A58G00J)、RPMI 1640培養基(美國Giboco公司，批號：8119267)、0.25%含EDTA胰酶(北京索萊寶公司，批號：20201217)、青霉素/鏈霉素(北京索萊寶公司，批號：20201101)、β-巰基乙醇(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：WH01112009XP)、LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20200613)、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20200411)、GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20200510)、GAPDH多克隆抗體(中國Proteintech公司，批號：10494-1-AP)、NF-κB抗體(美國Cell Signaling Technology公司，批號：CN89330)、p-NF-κB抗體(美國Cell Signaling Technology 公司，批號：16)、Bax抗體(中國Proteintech公司，批號：50599-2-lg)、Bcl-2抗體(中國Proteintech公司，批號：26593-1-AP)、辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體(Invitrogen中國公司，批號：VC303853)

1.3 主要儀器二氧化碳培養箱(Thermo Forma公司，型號：31111)、超凈工作臺(蘇州凈化設備總廠，型號：1450型)、小型高速冷凍離心機(德國ThermoIEC公司，型號：Micro CL17R)、熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會，型號：奧林巴斯CKX-41)、連續光譜掃描式酶標儀(香港分子儀器公司，型號：SpectraMaxPlus384)、垂直電泳儀(美國Bio-Rad中國有限公司)、雙色紅外熒光成像系統(美國Li-COR OdysseClx公司)。

1.4 MIN6細胞的培養將MIN6細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基中(含1%青霉素-鏈霉素、50 μmol·L-1β-巰基乙醇)，置于含5% CO2的37 ℃培養箱中培養，2～3 d換液1次，待細胞生長至接近融合時，用0.25%胰酶消化、傳代培養，繼續后續實驗。

1.5 MTT法檢測MIN6細胞的存活率將MIN6細胞制備成單細胞懸液，計數，以5×103/孔的密度接種于96孔板中。待細胞貼壁后，棄去培養基，將細胞分為正常組( Normal control )，模型組(Model control )，葛根素高、中、低劑量組(PR 5、2.5、1.25 mg·L-1)，分別加入相應濃度的含藥培養基或完全培養基預處理2 h后，除正常組外，其余各組加入120 μmol·L-1的棕櫚酸，共同培養24 h。每孔加入10 μL MTT試劑和90 μL無血清培養基，培養箱培養4 h后，酶標儀490 nm處檢測各孔吸光度值(A值)，計算細胞存活率。

1.6 細胞LDH、MDA和GSH的測定細胞分組及藥物處理見“1.5”項，各組細胞處理結束后，收集細胞上培養清液，根據LDH含量檢測試劑盒說明書，檢測并計算細胞上清中LDH含量。采用超聲破碎法破碎細胞，細胞破碎完畢后離心取上清，根據MDA含量檢測試劑盒和GSH檢測試劑盒說明書進行檢測和計算。

1.7 細胞AOEB染色及形態觀察將對數生長期的細胞按每孔5×104/孔的密度接種于6孔板中，細胞分組及藥物處理見“1.5”項，各組給藥處理結束后，棄除完全培養基或含藥培養基，用PBS輕柔清洗1遍細胞，每孔再加入500 μL的PBS，然后將配置好的AOEB工作液(將AO和EB兩種溶液按照1 ∶1混合配置)，5 μL/孔加入各組細胞中，室溫避光染色5 min，染色結束后，棄去熒光染液，用PBS清洗1遍細胞，采用倒置熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況并拍照記錄。

1.8 Western blot法檢測各組細胞Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白表達情況細胞分組及藥物處理見“1.5”項，各組細胞處理結束后，用PBS沖洗1～2次，各組加入含PMSF的RIPA裂解液裂解細胞，12 000g離心15 min，取上清即為各組細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，根據目的蛋白分子量的大小采用不同濃度的分離膠進行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉膜，TBST溶液洗膜3次后，4 ℃冰箱孵育按1 ∶500或1 ∶1 000稀釋的一抗過夜，TBST重新洗膜3次，每次5 min室溫搖床孵育加HRP標記的山羊兔二抗0.5～1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，雙色紅外熒光成像系統曝光掃膜，以GAPDH作為內參蛋白校正，實驗結果用ImageJ分析軟件進行灰度值分析。

2 結果

2.1 葛根素對MIN6細胞存活率的影響120 μmol·L-1棕櫚酸孵育MIN6細胞24 h后可以誘導MIN6細胞損傷(P<0.01)；與模型組相比，不同濃度葛根素預處理2 h后，120 μmol·L-1棕櫚酸共同孵育24 h可減輕棕櫚酸誘導的細胞損傷(P<0.01或P<0.05)。提示葛根素可有效改善棕櫚酸誘導的細胞損傷(Tab 1)。

Tab 1 Effects of PR on viability of palmitic

2.2 各組細胞上清液LDH含量的比較結果顯示，模型組LDH釋放量，MDA含量明顯增加，GSH活性明顯下降(P<0.01或P<0.05)，說明此時棕櫚酸對MIN6細胞造成了損傷。當加入不同濃度葛根素預處理2 h后,120 μmol·L-1棕櫚酸共同孵育24 h時，隨著葛根素濃度的增加，MIN6細胞中LDH釋放量呈現明顯(P<0.01或P<0.05)劑量依賴性下降趨勢，葛根素高、中劑量組MDA含量明顯降低，GSH活性明顯增加(P<0.01或P<0.05)。結果表明，葛根素能夠減輕棕櫚酸造成的細胞損傷(Tab 2)。

Tab 2 Effects of PR on level of LDH，MDA and GSH in palmitic acid-induced MIN6 cells

2.3 細胞AOEB染色及形態觀察如Fig 1所示，正常組細胞生長良好，貼壁情況良好，呈現亮綠色熒光，模型組細胞出現凋亡，發出橘紅色熒光，對于葛根素給藥組，高劑量組的呈現黃綠色熒光，中劑量開始出現早期凋亡細胞，呈現橘黃色熒光，低劑量組壞死細胞最多，呈現橘紅色熒光。結果提示，葛根素可以改善棕櫚酸引起的MIN6細胞凋亡。

Fig 1 Effects of PR on apoptosis of palmitic acid-induced MIN6 cells (200×)A: Normal control; B: Model group; C: PR 5 mg ·L-1; D: PR 2.5 mg·L-1；E: PR 1.25 mg·L-1

2.4 葛根素對MIN6細胞Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白表達的影響各組細胞中目的蛋白表達結果如Fig 2所示。與正常組相比，模型組中NF-κB p-p65、Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調(P<0.01)；與模型組相比，葛根素高、中劑量組NF-κB p-p65、Bax蛋白表達下調，Bcl-2蛋白表達上調(P<0.01或0.05)。提示葛根素能減少炎癥因子NF-κB p-p65蛋白和促凋亡因子Bax蛋白的表達，同時促進抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達。

Fig 2 Effects of PR on Bax，Bcl-2，p65 and p-p65 expression of palmitic acid-induced MIN6 cells

3 討論

T2DM的發病因素眾多，近年來，脂毒性在T2DM的發生發展中的作用受到廣泛關注。研究表明，長期暴露于高水平的游離FFA中，一方面會減少葡萄糖刺激的胰島素分泌，引起胰島素抵抗;另一方面可誘導胰島β細胞發生凋亡，激活炎癥因子，導致胰島細胞損傷[7-8]。因此，抑制脂毒性誘導的胰島細胞損傷有望成為治療T2DM的有效途徑之一。本研究采用棕櫚酸作為造模刺激物，從細胞水平來探討葛根素對脂毒性誘導的胰島β細胞的作用。實驗結果表明，MTT法、LDH、MDA和GSH試劑盒均提示葛根素具有改善棕櫚酸引起的MIN6細胞損傷的作用，AOEB熒光染色法結果提示葛根素具有抑制MIN6細胞凋亡的作用。

NF-κB是重要的核轉錄因子之一，在細胞炎癥、損傷中具有重要的調節作用[9]。當刺激因素激活后，NF-κB核轉移過程增強，其與相應的靶基因結合，參與調控一系列炎癥因子等促炎基因的表達，最終導致細胞功能受損甚至凋亡的發生。大量研究顯示[10-12]，NF-κB信號通路的激活與糖尿病發生的胰島β細胞凋亡及損傷密切相關，抑制NF-κB信號通路的活化可以有效保護胰島β細胞。Western blot結果表明，與正常組相比，模型組NF-κB p-p65表達明顯上調，說明造模成功。與模型組相比，葛根素高劑量組NF-κB p-p65表達明顯下調，提示葛根素有較好的抑制NF-κB通路活性，改善MIN6細胞損傷的作用。

β細胞凋亡在T2DM的發生發展過程中起到重要的作用，T2DM患者的胰島β細胞數量明顯減少[13-14]。Bcl-2家族的凋亡相關基因Bcl-2、Bax是調控胰島β細胞凋亡的重要因子。其中，Bcl-2是抑制細胞凋亡的基因蛋白，為線粒體膜的整合蛋白，可通過線粒體途徑、內質網途徑抵抗細胞凋亡；Bax是促進細胞凋亡的基因蛋白，當接收到凋亡信號刺激被激活后，分子構象發生改變，形成Bax/Bax二聚體，進而促進細胞凋亡[15-16]。Western blot結果顯示，與正常組相比，模型組Bax表達明顯上調，Bcl-2表達明顯下調，說明造模成功。與模型組相比，葛根素高、中劑量組Bax表達明顯下調，Bcl-2表達明顯上調，提示葛根素有明顯的抑制棕櫚酸引起的MIN6細胞凋亡的作用。

綜上所述，葛根素可改善棕櫚酸誘導的胰島MIN6細胞的氧化應激狀態，進而抑制凋亡和炎癥反應而改善胰島細胞的功能。因此，葛根素對胰島MIN6細胞的保護機制可能與調節凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達及抑制NF-κB信號通路有關。