肝癌中蛋白質翻譯后修飾的研究進展

柳 卓，田雪飛，曾普華

(1. 湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 412000；2. 湖南中醫藥大學科技處，湖南 長沙 412006)

肝癌是發于肝內膽管上皮細胞或肝細胞的惡性腫瘤，是中國導致死亡的第二大癌癥。2020年，全球確診為肝癌的人超過90萬，其中中國人有41萬[1]。肝癌具有起病隱匿、惡性度高、進展快、預后差和死亡率高等特點。晚期癥狀主要表現為肝痛、乏力、消瘦、黃疸、腹水等。肝癌容易在肝內及肝外發生轉移，易侵犯門靜脈及分支并形成瘤栓，肝外轉移分為血行、淋巴道、種植轉移等，嚴重影響患者的生命質量。肝癌早期，采用積極的手術治療配合介入及靜脈化療，并結合口服索拉菲尼等藥物積極予以治療，患者一般可以帶瘤生存。肝癌后期的治療有外科手術、肝移植、放化療等聯合手段，但其預后較差，容易反復發作，5年生存率僅為12.1%[2-3]。因此，提高肝癌患者的生存率，早治療、早診斷非常必要。

蛋白質翻譯后修飾(protein translational modifications，PTMs)是指通過共價加工1個或幾個氨基酸殘基加上修飾基團或通過蛋白質水解剪去基團而改變蛋白質的性質[4]。這個過程是采用可逆的狀態模式，調節蛋白功能，改變理化性質。目前已發現300多種不同的翻譯后修飾，主要形式包括磷酸化、糖基化、乙?；⒎核鼗?。在蛋白翻譯后修飾方式的鑒定過程中，蛋白會首先被酶切成肽段，然后進入質譜進行分析，通過質譜分析，得到的是一系列肽段的分子質量信息[4]。對于某一個特定肽段而言，在沒有發生任何翻譯后修飾的情況下，其序列信息和分子量是確定的。因此，可以更直觀的了解到PTMs的作用。很多研究表明，PTMs跟腫瘤代謝密切相關，并能調控腫瘤抑制因子與癌蛋白的表達。本文就PTMs的幾種形式在肝癌中的作用進行綜述，并探索其相關藥物開發前景，為肝癌干預診斷提供新的思路。

1 糖基化

蛋白質的糖基化是一種最常見的蛋白翻譯后修飾，是在糖基轉移酶作用下將糖類轉移至蛋白質和蛋白質上特殊的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。研究表明70%人類蛋白包含一個或多個糖鏈，1%的人類基因組參與了糖鏈的合成和修飾[5]。

糖基化主要分為O-糖基化和N-糖基化。蛋白質蘇氨酸或絲氨酸的自由OH基與O-糖鏈共價連接稱為O-糖基化，蛋白質天冬氨酸的自由NH2基與N-糖鏈共價連接稱為N-糖基化[6]。研究顯示，異常糖基化修飾能影響腫瘤細胞的生長、治療診斷以及轉移侵襲等[6]。異常糖基化修飾在肝癌中常常出現，影響相關蛋白的生物學活性，在增強化療效果和化療耐藥中發揮重要作用，并能用于診斷標記。除此之外，蛋白質糖基化在肝癌中還表現出如下作用。

1.1 肝癌診斷標記人羧酸酯酶1(carboxylesterase 1，CES1)是一種絲氨酸酯酶，在CES1的N79端含有一個獨特的單糖連接糖基，CES1的單鏈糖基化對肝癌細胞具有抗增殖作用，是肝細胞癌的血清標志物之一[7]。此外，血漿中的纖維蛋白原Aα亞型細胞中O-聚糖糖基化的數量在肝硬化患者中降低，而血漿中纖維蛋白原Bβ和γ-亞基在肝硬化和肝癌患者中均升高，基于此可3 h內判斷患者是否患有肝病[8]。

1.2 促進肝癌侵襲O-連接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)在PTMs中發揮調控作用，O-GlcNAc糖基化修飾是在糖基轉移酶OGT的催化下以O-糖苷鍵形式共價連接到蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸羥基上的單糖修飾[9]。在小分子RNA研究方面，肝癌組織和細胞中表現出miR-424-5p通過負調節O-GlcNAc，抑制原癌基因絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶有絲分裂原激活蛋白酶(rapidly accelerated fibrosarcoma 1，RAF1)糖基化，從而促進腫瘤轉移[10]。

1.3 肝癌代謝相關Chen等[11]發現鐵死亡誘導劑Erastin通過抑制O-GlcNAc糖基化修飾c-Jun來調節肝癌的代謝相關核表達和轉錄活性，并能進一步抑制人重組AP1(c-Jun)蛋白表達，同時谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成受O-GlcNAc糖基化修飾c-Jun的調控。臨床中已發現O-GlcNAc糖基化修飾c-Jun與GSH之間有正相關，GSH參與體內三羧酸循環及糖代謝。所以蛋白糖基化可能與肝癌能量代謝有相關性。

2 磷酸化

蛋白質磷酸化是最重要的一種蛋白PTMs之一。磷酸化是指在蛋白質或中間代謝產物上加磷酸基團的過程。蛋白質磷酸化主要發生在絲氨酸和蘇氨酸上，具有參與細胞信號傳導及通路調控的重要作用，跟轉錄調節、信號傳導、DNA損傷修復等過程密切相關[12]。Di等[13]發現磷酸化在癌癥生長中發揮重要作用：當磷酸化時，癌細胞中的脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase 2，PHD2)發揮活性，能促進癌細胞在腫瘤的低氧區域的死亡。在肝癌中，蛋白的磷酸化主要發揮以下作用。

2.1 肝癌的診斷標記磷酸化的Aα-纖維蛋白原亞型在肝癌患者中降低，而肝硬化單磷酸化增加，可作為肝癌和肝硬化的診斷依據[8]。在建立肝癌動物模型中通過蛋白質組學分析，從433種蛋白中篩選發現抑癌蛋白組磷酸賴氨酸磷酸組氨酸無機焦磷酸性磷酸酶(phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase，LHPP)，進一步研究發現LHPP的水平出現了下調并能影響肝癌的生長，增加LHPP表達則能夠有效抑制癌細胞增殖并阻止肝功能損傷[14]。

2.2 影響肝癌增殖肝癌細胞異常分泌的蛋白激酶Cδ(protein kinase C-delta，PKCδ)能與硫酸乙酰肝素類磷脂酰肌醇蛋白聚糖3結合并可錨定在肝癌細胞表面從而調節肝癌細胞的增殖。更進一步研究發現PKCδ能激活促生長因子(insulin-like growth factors-1，IGF-1)受體(IGF1R)，進而增強細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)的活性，從而加速肝癌細胞的生長，可見，抗PKCδ能減少肝癌細胞的增殖以及腫瘤生長，可應用于肝癌治療[15]。

3 乙酰化

乙?；饕唤M蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)和組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase 1，HAT)調控并發生在賴氨酸殘基上。乙酰化修飾對各種細胞信號傳導、細胞核功能及相關通路調控有調節作用，可以改變關鍵的代謝酶類的功能，從而促進癌細胞的快速增殖，蛋白被乙酰化后會參與細胞周期阻滯、細胞分化、腫瘤免疫等[16]。很多癌癥發生發展過程中，HDAC抑制劑能有選擇性的調節相關的因子和抑癌基因的表達，從而發揮較強的抗癌作用[17]。

3.1 致癌作用首先，乙?；梢杂绊懜伟┘毎奶谴x關鍵酶。磷酸甘油激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)是代謝性糖酵解途徑中的重要酶，PGK1 K323位點的乙?；艽龠M其酶活性和癌細胞代謝，肝癌組織中PGK1明顯過表達，PGK1的缺失顯著降低了癌細胞的增殖和腫瘤發生[18]。其次，可以通過自噬促發增殖。組蛋白去乙酰化酶HDAC3促進組蛋白H4在賴氨酸16位點的乙酰化，作用于磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)并增強自噬相關的微管相關蛋白1A/1B-輕鏈 3(MAP1LC3，LC3)和半胱氨酸蛋白酶(autophagy related 4 homolog，ATG4)之間的相互作用，從而觸發細胞自噬，影響肝細胞增殖[19]。

3.2 腫瘤的轉移蛋白乙?；瘏⑴c腫瘤血管生成相關的腫瘤細胞遷移。5號染色體的基因(spermatogenic Zip 1，SPZ1)在腫瘤發生過程中作為原癌基因和人Twist相關蛋白1(TWIST1)的乙?；纬蒘PZ1-TWIST1復合物，是癌細胞遷移的必需物。使用人源化單克隆血管生長因子中和抗體如貝伐珠單抗能有效地消除乙?；疭PZ1-TWIST1復合物誘導的誘導上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和腫瘤發生轉移[20]。

3.3 肝癌標志作用組蛋白H3第27位賴氨酸的乙酰化(H3K27ac)是活躍的增強子已知的最佳表觀遺傳標記物，其轉錄活性受到多個組蛋白賴氨酸位點乙?；膮f同作用的調控[21]。研究表明，組蛋白乙酰轉移酶活性的核受體共激活因子3(nuclear receptor coactivator 3，NCOA3)的富集與HGF處理反應位點的H3K27ac相關：NCOA3通過肝細胞生長因子(human growth factor，HGF)信號級聯在轉錄上調節G蛋白偶聯受體溶血磷脂酸受體6(LPAR6)，LPAR6與肝癌細胞HGF信號轉導之間存在表觀遺傳聯系，因此，LPAR6可作為肝癌治療干預的生物標志物[22]。

3.4 調節肝癌代謝能量平衡線粒體核糖體蛋白S5(mitochondrial ribosomal protein S5，MRPS5)已被證明在肝癌代謝過程中參與肝癌細胞代謝重編程發揮重要作用。生物信息學分析表明，MRPS5與線粒體復合體I的功能密切相關。進一步的實驗證實MRPS5促進了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的產生，增強肝癌細胞線粒體功能，參與能量調節。乙?；疢RPS5能直接導致糖酵解蛋白的表達增加并促進Warburg效應。而去乙?；疢RPS5定位于線粒體，促進線粒體復合物-I功能和NAD的生成，增強線粒體呼吸，調節癌細胞能量代謝[23]。

4 泛素化

泛素化(包括類泛素化)作為重要的蛋白質翻譯后修飾，一直是腫瘤生物學研究的重點和熱點。泛素化修飾是一個可逆的酶級聯反應，由泛素連接酶和去泛素化酶等精確調控。泛素化過程通常需要3種泛素酶的協同作用，其中E1泛素激活酶與E2泛素偶聯酶激活泛素，將其鏈接到蛋白底物上，而泛素連接酶在靶蛋白的特異性識別及泛素化系統活性的調控中起最重要的作用。泛素連接酶在靶蛋白的特異性識別及泛素化系統活性調節中起著重要的作用[24]。迄今有近600種E3泛素連接酶和100種去泛素化酶被報道。泛素化修飾后能抑制底物泛素-蛋白酶體途徑降解，進而參與細胞周期、自噬、天然免疫等多種生理過程的調節。在肝癌中蛋白泛素化還能表現出如下功能。

Fig 1 Post translational modification of proteins in liver cancer

4.1 調節肝癌穩定信號Tribbles同源物2(TRIB2)對實體惡性腫瘤和非實體惡性腫瘤都至關重要。肝癌細胞中TRIB2表達上調，TRIB2與E3泛素連接酶發揮作用，從而調節下游效應器的蛋白質穩定性：TRIB2為肝癌特異性Wnt/β-連環蛋白信號轉導下游靶點，可見TRIB2蛋白泛素化在肝癌細胞存活和轉化中起重要作用[25]。

4.2 肝癌治療藥物敏感相關阿霉素是常用的治療肝癌的化合物，在最近對其化療藥的敏感性研究中表明沉默信息調節因子6(silent information regulator，SIRT6)能預防阿霉素誘導的細胞死亡。SIRT6使叉形頭轉錄因子的O亞型(FOXO3)上調，同時增加FOXO3泛素化減低其穩定性。從而預防阿霉素誘導的細胞死亡作用[26]。

4.3 調節肝癌預后TCP1復合物的伴侶蛋白(chaperonin containing TCP-1 complex，CCT)亞基3是一種非核蛋白，CCT3能阻斷多聚胞嘧啶結合蛋白2的泛素化，從而延長癌蛋白Yes相關蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP1)和轉錄因子CP2(TFCP2)的半衰期。臨床上，CCT3與YAP和TFCP2呈正相關，CCT3-YAP-TFCP2軸水平升高可能是調節肝臟惡性腫瘤預后的關鍵[27]。

4.4 調節肝癌能量平衡在E3連接酶腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)催化下，賴氨酸63型連接多聚泛素化對自噬受體蛋白的后續識別起著重要作用。TRAF6介導的泛素化系統，通過自噬調節糖酵解，為治療自噬受損肝癌的糖解治療干預開辟了一條途徑[28]。

5 展望

已有大量證據證實，PTMs參與調節肝癌的生長增殖、侵襲轉移、藥物材料和放射敏感性等。在肝癌的治療干預及預后均體現其初步價值。現在研究表明，PTMs相關的藥物聯合使用，安全性較好、靶向性高，但仍然需要更多實驗驗證。