超聲輔助酶法提取黔產青錢柳多糖

◎ 吳超群，佀勝利

（凱里學院，貴州 凱里 556000）

青錢柳（Cyclocarya paliurus）又名青錢李、搖錢樹、山溝樹等，是我國特有的珍稀植物，具有廣泛的食用和藥用價值。《全國中草藥名鑒》有記載：“青錢柳樹葉、樹皮及其根，能殺蟲止癢，有消炎、止痛、祛風之功效”，民間常用于清熱消腫、生津止渴，被譽為降糖神茶[1]。青錢柳葉中含有多種活性成分，包括黃酮類物質、三萜類物質、多糖、有機酸類等[2-3]。其中青錢柳多糖是主要的活性成分之一，并且已被證實具有降血糖、降血脂、抗氧化及抗癌等多種生理活性[4-7]。

目前多糖提取方法有熱水浸提法[8]、酸水解[9]、堿提法[10]、溶劑回流提取[11]等，但提取效率不高。超聲利用粉碎、空化特性破壞植物細胞，結合酶法通過纖維素酶分解細胞壁，加速有效成分的溶出，超聲輔助酶法結合兩者優勢，相較于傳統提取方法，其具有高效、省時的優點。本文以黔產青錢柳為原料，采用超聲輔助酶法提取，應用單因素試驗與正交試驗優化提取工藝，為青錢柳的開發利用以及其生物學活性研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黔東南地區青錢柳葉，干燥，粉碎過60目篩；纖維素酶，30 U·mg-1，和氏璧生物科技有限公司；D(+)-無水葡萄糖標準品，純度＞98%，成都曼思特生物科技有限公司；磷酸氫二鈉，分析純，天津市天大化學試劑；檸檬酸鈉，分析純，天津市瑞金特化學品有限公司；苯酚、濃硫酸，分析純，西隴科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

VGT-2127QTD數顯恒溫超聲儀器，上海旦鼎國際貿易有限公司；AF-04A粉碎機，溫嶺市奧力中藥器械有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；AR224CN電子天平，奧豪斯儀器有限公司；AXTD5A離心機，鹽城市安信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青錢柳多糖提取方法

準確稱取青錢柳粉末0.5 g置于50 mL離心管中，加入適量的纖維素酶及適量的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調整pH，在50 ℃下酶解適宜時間，再進行沸水滅酶15 min，超聲一定時間，4 000 r·min-1離心15 min，取上清液定容100 mL，待測。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取葡萄糖標準品10.00 mg，加蒸餾水定容至50 mL，制得0.2 mg·mL-1的標準品溶液。精密吸取0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL的標準品溶液，加蒸餾水定容至25 mL，備用。再分別移取備用液2 mL于6個具塞試管中，分別加入6%苯酚溶液1 mL與濃硫酸溶液5 mL，搖勻，靜置30 min，于490 nm波長處測吸光度。以吸光度A為縱坐標，葡萄糖標準瓶濃度C（mg·mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：A=0.109 9C+0.005 7，R2=0.999 5。

1.3.3 青錢柳多糖的含量測定

精密吸取青錢柳待測液1 mL，按上述方法，于490 nm下測定吸光度。根據標準曲線計算青錢柳多糖質量濃度，根據式（1）計算青錢柳多糖含量：

式中：n為稀釋倍數；C為標準曲線計算得青錢柳質量濃度，mg·mL-1；V為青錢柳提取液體積，mL；m為青錢柳質量，g。

1.3.4 單因素試驗設計

在黔產青錢柳多糖提取工藝單因素試驗中，分別選取酶添加量、酶解pH、超聲時間3個主要因素，其中酶添加量分別為2%、3%、4%、5%和6%；酶解pH分別為4、5、6、7和8；超聲時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，采用青錢柳多糖提取含量為評價指標，考察不同因素對其提取含量的影響。

1.3.5 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取酶添加量、酶解pH、超聲時間3個單因素，采用L9(34)正交試驗，以青錢柳多糖含量為指標，確定超聲輔助酶法提取青錢柳總多糖的最佳提取工藝條件，正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.6 數據處理

采用正交設計助手ⅡV3.1對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶添加量結果分析

按“1.3.4”項下方法，以青錢柳總多糖含量為考察指標，考察不同酶添加量對青錢柳總多糖含量的影響。由圖1可知，隨著酶添加量的增加，青錢柳多糖的含量呈現先升高后再降低趨勢，當酶添加量為4%時，青錢柳多糖含量達到最高，但酶添加量高于4%時，青錢柳多糖含量隨著酶添加量的增加而下降。

2.1.2 酶解pH值結果分析

按“1.3.4”項下方法，以青錢柳總多糖含量為考察指標，考察不同酶解pH值對青錢柳多糖含量的影響。由圖2可知，隨著酶解pH值的增加，青錢柳多糖含量呈現先升高再降低的趨勢，當酶解pH為6時，青錢柳多糖含量達到最高，而后隨著酶解pH的升高青錢柳多糖含量降低，主要是由于維持酶的活性需要適宜的pH，pH過高或者過低都會影響酶的活性。

2.1.3 超聲時間結果分析

按“1.3.4”項下方法，以青錢柳總多糖含量為考察指標，考察不同超聲時間對青錢柳多糖含量的影響。由圖3可知，隨著超聲時間的增加，青錢柳多糖含量呈現先升高再降低的趨勢，當超聲時間為30 min，青錢柳多糖含量達到最高，此時酶促反應與超聲效果均達到最佳。當超聲時間超過30 min，青錢柳多糖含量隨時間增加逐漸降低，可能是由于超聲時間過長使部分青錢柳多糖因剪切力過大而結構裂解，造成含量減少。

2.2 正交試驗結果分析

在單因素試驗基礎上，結合正交試驗因素水平表，對酶添加量（A），酶解pH值（B）、超聲時間（C）3個因素，以青錢柳多糖含量為指標開展正交試驗，試驗結果如表2所示。由R值可知，影響青錢柳多糖含量的主要因素排列順序為酶解pH＞酶添加量＞超聲時間。由K值可知，最優組合為A2B2C1，即酶添加量4.5%、酶解pH=6.0、酶解超聲時間30 min。

表2 正交試驗結果表

2.3 驗證試驗

為驗證L9(34)正交試驗優化青錢柳多糖提取工藝可靠性，準確稱取0.5 g青錢柳粉末于50 mL離心管中，分別在A2B2C1條件下進行試驗，平行3次，測定青錢柳多糖含量為16.23%，RSD值為1.72%，均高于單因素與正交試驗的多糖含量，表明超聲輔助酶法提取青錢柳多糖的最優條件（A2B2C1）穩定合理。

3 結論

本研究通過單因素試驗和正交試驗優化得到超聲輔助酶法提取黔產青錢柳的最優工藝為酶添加量4.5%、酶解pH=6.0、酶解超聲時間30 min。驗證試驗結果顯示，在最優條件下，青錢柳多糖含量為16.23%，RSD值為1.72%，表明該提取方法可靠，可用于青錢柳多糖提取，為青錢柳的進一步開發利用奠定基礎。