超聲輔助酶法提取黔產(chǎn)青錢柳多糖

◎ 吳超群，佀勝利

（凱里學(xué)院，貴州 凱里 556000）

青錢柳（Cyclocarya paliurus）又名青錢李、搖錢樹、山溝樹等，是我國特有的珍稀植物，具有廣泛的食用和藥用價值。《全國中草藥名鑒》有記載：“青錢柳樹葉、樹皮及其根，能殺蟲止癢，有消炎、止痛、祛風(fēng)之功效”，民間常用于清熱消腫、生津止渴，被譽為降糖神茶[1]。青錢柳葉中含有多種活性成分，包括黃酮類物質(zhì)、三萜類物質(zhì)、多糖、有機酸類等[2-3]。其中青錢柳多糖是主要的活性成分之一，并且已被證實具有降血糖、降血脂、抗氧化及抗癌等多種生理活性[4-7]。

目前多糖提取方法有熱水浸提法[8]、酸水解[9]、堿提法[10]、溶劑回流提取[11]等，但提取效率不高。超聲利用粉碎、空化特性破壞植物細胞，結(jié)合酶法通過纖維素酶分解細胞壁，加速有效成分的溶出，超聲輔助酶法結(jié)合兩者優(yōu)勢，相較于傳統(tǒng)提取方法，其具有高效、省時的優(yōu)點。本文以黔產(chǎn)青錢柳為原料，采用超聲輔助酶法提取，應(yīng)用單因素試驗與正交試驗優(yōu)化提取工藝，為青錢柳的開發(fā)利用以及其生物學(xué)活性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黔東南地區(qū)青錢柳葉，干燥，粉碎過60目篩；纖維素酶，30 U·mg-1，和氏璧生物科技有限公司；D(+)-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞98%，成都曼思特生物科技有限公司；磷酸氫二鈉，分析純，天津市天大化學(xué)試劑；檸檬酸鈉，分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；苯酚、濃硫酸，分析純，西隴科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VGT-2127QTD數(shù)顯恒溫超聲儀器，上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司；AF-04A粉碎機，溫嶺市奧力中藥器械有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；AR224CN電子天平，奧豪斯儀器有限公司；AXTD5A離心機，鹽城市安信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青錢柳多糖提取方法

準(zhǔn)確稱取青錢柳粉末0.5 g置于50 mL離心管中，加入適量的纖維素酶及適量的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液調(diào)整pH，在50 ℃下酶解適宜時間，再進行沸水滅酶15 min，超聲一定時間，4 000 r·min-1離心15 min，取上清液定容100 mL，待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，加蒸餾水定容至50 mL，制得0.2 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加蒸餾水定容至25 mL，備用。再分別移取備用液2 mL于6個具塞試管中，分別加入6%苯酚溶液1 mL與濃硫酸溶液5 mL，搖勻，靜置30 min，于490 nm波長處測吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)瓶濃度C（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：A=0.109 9C+0.005 7，R2=0.999 5。

1.3.3 青錢柳多糖的含量測定

精密吸取青錢柳待測液1 mL，按上述方法，于490 nm下測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算青錢柳多糖質(zhì)量濃度，根據(jù)式（1）計算青錢柳多糖含量：

式中：n為稀釋倍數(shù)；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得青錢柳質(zhì)量濃度，mg·mL-1；V為青錢柳提取液體積，mL；m為青錢柳質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計

在黔產(chǎn)青錢柳多糖提取工藝單因素試驗中，分別選取酶添加量、酶解pH、超聲時間3個主要因素，其中酶添加量分別為2%、3%、4%、5%和6%；酶解pH分別為4、5、6、7和8；超聲時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，采用青錢柳多糖提取含量為評價指標(biāo)，考察不同因素對其提取含量的影響。

1.3.5 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取酶添加量、酶解pH、超聲時間3個單因素，采用L9(34)正交試驗，以青錢柳多糖含量為指標(biāo)，確定超聲輔助酶法提取青錢柳總多糖的最佳提取工藝條件，正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用正交設(shè)計助手ⅡV3.1對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶添加量結(jié)果分析

按“1.3.4”項下方法，以青錢柳總多糖含量為考察指標(biāo)，考察不同酶添加量對青錢柳總多糖含量的影響。由圖1可知，隨著酶添加量的增加，青錢柳多糖的含量呈現(xiàn)先升高后再降低趨勢，當(dāng)酶添加量為4%時，青錢柳多糖含量達到最高，但酶添加量高于4%時，青錢柳多糖含量隨著酶添加量的增加而下降。

2.1.2 酶解pH值結(jié)果分析

按“1.3.4”項下方法，以青錢柳總多糖含量為考察指標(biāo)，考察不同酶解pH值對青錢柳多糖含量的影響。由圖2可知，隨著酶解pH值的增加，青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，當(dāng)酶解pH為6時，青錢柳多糖含量達到最高，而后隨著酶解pH的升高青錢柳多糖含量降低，主要是由于維持酶的活性需要適宜的pH，pH過高或者過低都會影響酶的活性。

2.1.3 超聲時間結(jié)果分析

按“1.3.4”項下方法，以青錢柳總多糖含量為考察指標(biāo)，考察不同超聲時間對青錢柳多糖含量的影響。由圖3可知，隨著超聲時間的增加，青錢柳多糖含量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，當(dāng)超聲時間為30 min，青錢柳多糖含量達到最高，此時酶促反應(yīng)與超聲效果均達到最佳。當(dāng)超聲時間超過30 min，青錢柳多糖含量隨時間增加逐漸降低，可能是由于超聲時間過長使部分青錢柳多糖因剪切力過大而結(jié)構(gòu)裂解，造成含量減少。

2.2 正交試驗結(jié)果分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗因素水平表，對酶添加量（A），酶解pH值（B）、超聲時間（C）3個因素，以青錢柳多糖含量為指標(biāo)開展正交試驗，試驗結(jié)果如表2所示。由R值可知，影響青錢柳多糖含量的主要因素排列順序為酶解pH＞酶添加量＞超聲時間。由K值可知，最優(yōu)組合為A2B2C1，即酶添加量4.5%、酶解pH=6.0、酶解超聲時間30 min。

表2 正交試驗結(jié)果表

2.3 驗證試驗

為驗證L9(34)正交試驗優(yōu)化青錢柳多糖提取工藝可靠性，準(zhǔn)確稱取0.5 g青錢柳粉末于50 mL離心管中，分別在A2B2C1條件下進行試驗，平行3次，測定青錢柳多糖含量為16.23%，RSD值為1.72%，均高于單因素與正交試驗的多糖含量，表明超聲輔助酶法提取青錢柳多糖的最優(yōu)條件（A2B2C1）穩(wěn)定合理。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化得到超聲輔助酶法提取黔產(chǎn)青錢柳的最優(yōu)工藝為酶添加量4.5%、酶解pH=6.0、酶解超聲時間30 min。驗證試驗結(jié)果顯示，在最優(yōu)條件下，青錢柳多糖含量為16.23%，RSD值為1.72%，表明該提取方法可靠，可用于青錢柳多糖提取，為青錢柳的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。