蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素Cereulide研究進展

◎ 種 婷

（遼寧省檢驗檢測認證中心，遼寧 沈陽 110032）

1 蠟樣芽孢桿菌的危害

蠟樣芽孢桿菌是一種普遍存在于自然環(huán)境中的細菌，如存在于土壤、空氣、水中等，是芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，可產(chǎn)生內(nèi)孢子。蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒占全球所有食物中毒事件的1.4%～12.0%，2018年歐盟有98起由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件，蠟樣芽孢桿菌毒素繼沙門氏菌、彎曲桿菌、諾如病毒和金黃色葡萄球菌之后排在第5位[1-2]。2018年中國疾病預防控制中心衛(wèi)生應急中心發(fā)布的我國食物中毒事件數(shù)據(jù)顯示，由蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件占細菌性食物中毒事件總數(shù)和中毒總?cè)藬?shù)的5.61%和6.80%，僅次于沙門氏菌、副溶血性弧菌、致泄大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及其腸毒素，位列第5位[3]。關于蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素Cereulide引起的食物中毒報告越來越多，由于嘔吐毒素Cereulide是原料中的蠟樣芽孢桿菌在生長過程中預先形成的，因此在某些中毒事件中只檢測到Cereulide，沒有分離出蠟樣芽孢桿菌[4]。

2 嘔吐毒素Cereulide的特性

Cereulide最初由AGATA等[5]發(fā)現(xiàn)，是一種環(huán)狀十二肽，由6個α-氨基酸和6個α-羥基酸組成，基本的氨基酸序列為[D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-DVal]3。其結(jié)構(gòu)特點是肽和酯鍵交替鍵合（圖1），具有高度親脂性和極強的耐熱性，在pH值為2～11范圍穩(wěn)定，在121 ℃下持續(xù)2 h后也不會失去活性，它對胃蛋白酶和胰蛋白酶具有抵抗力，不會在通過宿主胃時失活。由于其分子量為1.2 kDa，不能通過食品加工中的常規(guī)滅菌方式（如真空除菌或過濾）去除，也不會通過熱處理使其失活，所以Cereulide幾乎不能被去除或滅活[6]。因此，防止其在食品生產(chǎn)和加工中合成至關重要。

3 嘔吐毒素Cereulide的合成及影響因素

Cereulide由一種非核糖體肽合成酶（Non-ribosomal Peptide Synthetase，NRPS）合成，稱為Ces-NRPS[7]。NRPS是大型模塊化多酶復合物，編碼Cereulide合成酶的基因位點顯示了NRPS基因團的典型結(jié)構(gòu)。ces基因在pCER270巨型質(zhì)粒上編碼，該質(zhì)粒與來自炭疽桿菌的pXO1毒素質(zhì)粒類似[8]。24 kb ces基因團總共包含7個編碼序列。cesA和cesB是結(jié)構(gòu)性合成酶基因，除了結(jié)構(gòu)合成酶基因外，相應的基因位點通常包含參與激活NRPS的基因，在ces基因的5'端有cesH一種功能未知的水解酶；cesP一種磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶（Phosphopantetheinyl Transferase，PPtase），參與合成酶的活化；cesT是一種II型硫酯酶，被認為與去除錯誤引發(fā)的單體有關。在ces基因的3'端，有兩個編碼序列，稱為cesC和cesD，編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白。轉(zhuǎn)運子ABC不僅負責轉(zhuǎn)運毒素，并且將cesA、cesB合成酶固定在細胞膜上，在Cereulide生物合成中發(fā)揮重要作用[9]。

有研究發(fā)現(xiàn)，染色體上的關鍵轉(zhuǎn)錄因子cesP、cesT、cesA、cesB、cesC和cesD在合成Cereulide上起著關鍵作用。LüCKING等[10]對蠟樣芽孢桿菌F4810/72的缺失突變體進行研究，發(fā)現(xiàn)ces基因不受PlcR的控制，ces基因受Spo0A-AbrB控制。spo0A的sigma（A）驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄對Cereulide合成至關重要，而spo0A的sigma（H）驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄不影響Cereulide的合成。AbrB被證明可以有效地與ces操縱子的主要啟動子區(qū)域結(jié)合，這表明AbrB通過對ces轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生負面影響而充當Cereulide合成的阻遏物。相比之下，CodY作為全局轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在Cereulide合成中起關鍵作用，CodY的缺失導致PlcR的毒力基因下調(diào)，同時ces基因上調(diào)，CodY被發(fā)現(xiàn)是ces操縱子的阻遏子，CodY與免疫抑制劑金屬蛋白酶InhA1的啟動子結(jié)合，將蠟樣芽孢桿菌的代謝與毒力聯(lián)系起來[11]。

不僅內(nèi)在因素對Cereulide的產(chǎn)生有影響，外在環(huán)境因素對Cereulide的產(chǎn)生亦有重大影響[4]。研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌生長速率和Cereulide產(chǎn)量是不相關的，這表明僅用細菌數(shù)量或生長速率預測Cereulide產(chǎn)生風險是不合適的。MARXEN等[12]用質(zhì)譜法對Cereulide進行研究，發(fā)現(xiàn)Cereulide至少有18種異構(gòu)體，并且首次發(fā)現(xiàn)isocereulides A～G異構(gòu)體。KRANZLER等[13]研究發(fā)現(xiàn)，溫度不僅影響Cereulide的總量，還影響Cereulide異構(gòu)體的形成，并且異構(gòu)體的毒性顯著不同，isocereulide A的毒性比Cereulide高8～10倍，而其他亞型幾乎無毒，因此預測Cereulide產(chǎn)生方面應考慮溫度的影響。一般來說，在中性pH值、淀粉、碳水化合物、維生素和微量元素含量高的食品中易產(chǎn)生Cereulide，而低氧水平和高NaCl濃度會產(chǎn)生負面影響[2]。

4 結(jié)語

蠟樣芽孢桿菌嘔吐毒素引起的中毒事件日趨增多，嘔吐毒素的耐熱性和化學穩(wěn)定性使其難以被消除和破壞。因此，在食品制造過程或儲存過程中及時發(fā)現(xiàn)Cereulide的存在顯得尤為重要。傳統(tǒng)微生物法檢驗蠟樣芽孢桿菌檢驗周期長、效率低，而且不能區(qū)分蠟樣芽孢桿菌是否產(chǎn)嘔吐毒素。以已知非核糖體肽合成酶（NRPS）的高度保守基因序列為靶點的簡并寡核苷酸引物用于擴增和鑒定蠟樣芽孢桿菌中假定的NRPS基因片段，設計了用于檢測產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌的PCR系統(tǒng)[14]和TaqMan探針的實時PCR系統(tǒng)[15]。近年來，質(zhì)譜技術的進步也顯著提高了嘔吐毒素的鑒定診斷水平。基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜可以基于某些生物標志物直接檢測Cereulide，以區(qū)分產(chǎn)嘔吐毒素和不產(chǎn)嘔吐毒素的蠟樣芽孢桿菌[16]。研究人員要根據(jù)Cereulide的特點開發(fā)新方法、新技術，以期快速、準確、高效地檢測Cereulide，為食品安全提供保障。