超高效液相色譜法測(cè)定蟹苗中孔雀石綠的殘留

◎ 汪 杰，鄭 丹，楊家鋒，梁芹芹，方 磊

（寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江 寧波 315000）

孔雀石綠是有毒的三苯甲烷類化學(xué)物，可以殺寄生蟲和殺菌，可用于化工染料。此外，孔雀石綠還能夠在養(yǎng)殖水產(chǎn)中治療三代蟲病、車輪蟲病、鰓霉病、指環(huán)蟲病、斜管蟲病、小瓜蟲病和其他一些細(xì)菌性疾病，曾經(jīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)普遍使用。但孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無(wú)色孔雀石綠具有高毒性殘留，容易致畸、致癌。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已將孔雀石綠列為禁藥，無(wú)公害水產(chǎn)品中食品標(biāo)準(zhǔn)漁藥殘留限量規(guī)定不得檢出孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無(wú)色孔雀石綠[1]。

蟹類是寧波水產(chǎn)品養(yǎng)殖主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一，是人們食用水產(chǎn)品的主要成分之一，因此保證蟹類產(chǎn)品的食用安全對(duì)于保障人們身體健康和水產(chǎn)品出口意義重大。隨著人們對(duì)食品安全的關(guān)注以及政府部門對(duì)食品安全監(jiān)管的重視，測(cè)定蟹苗中孔雀石綠有重要意義[2]。

現(xiàn)階段檢測(cè)水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物的方法主要為高效液相色譜法、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）等[3-4]。實(shí)驗(yàn)通過(guò)空白樣品加標(biāo)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線來(lái)排除樣品的基質(zhì)效應(yīng)干擾，使用乙腈提取、硼氫化鉀還原、離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，過(guò)中性氧化鋁柱-PRS小柱串聯(lián)裝置，洗脫過(guò)微孔濾膜上機(jī)測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-熒光檢測(cè)器，1200LC，美國(guó)安捷倫科技有限公司；漩渦混勻儀，MS3，德國(guó)IKA公司；臺(tái)式離心機(jī)，DL-8M，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，R215，瑞士BUCHIR公司；分析天平，BP211D，感應(yīng)量0.001 g，德國(guó)賽多利斯公司；色譜柱，kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），瑞典AKZO NOBEL公司。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈，色譜純，天地。

1.0 mol·L-1對(duì)-甲苯磺酸：稱取17.2 g一水-對(duì)甲苯磺酸，并用水稀釋到100 mL；二甘醇；固相萃取柱：中性氧化鋁柱，1 g，Sμpeclean LC-alμmina-N，或相當(dāng)者，PRS小柱。

1.3 溶液配制

（1）醋酸鹽緩沖液配制。稱取4.95 g無(wú)水醋酸鈉和0.95 g對(duì)甲苯磺酸溶解于900 mL純水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH=4.5，最后用水稀釋到1 000 mL。稱取12 g鹽酸羥胺溶解在50 mL水中配制成20%鹽酸羥胺水溶液。用移液槍移取1 mL20%鹽酸羥胺水溶液至100 mL容量瓶中，用甲醇準(zhǔn)確定容至刻度線，配制成0.2%鹽酸羥胺甲醇溶液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度＞98%。用天平準(zhǔn)確稱取適量的無(wú)色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并用純甲醇溶解成濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用純甲醇稀釋成濃度為20 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.4 提取

用50 mL離心管稱取5.0 g蟹苗樣品，離心管內(nèi)加入20%鹽酸羥胺水溶液1.0 mL、1.0 mol·L-1對(duì)-甲苯磺酸溶液2.0 mL、乙鹽緩沖液3.0 mL，用勻質(zhì)機(jī)以15 000 r·min-1的速度均質(zhì)40 s，然后加入10 mL提取劑和10 g酸性氧化鋁在搖床中振搖3 min。將離心管置于離心機(jī)內(nèi)以4 000 r·min-1的速度離心5 min。把上清液轉(zhuǎn)移至加有3 mL二甘醇的新50 mL離心管中，然后在原50 mL離心管中加入10 mL提取劑，重復(fù)上述操作，將上清液合并至新50 mL離心管中。加入0.5 mL硼氫化鉀溶液還原5 min。

1.5 凈化

在新的塑料離心管中加入10 mL二氯甲烷，混勻10 s后，離心機(jī)內(nèi)3 000 r·min-1離心5 min。用尖嘴移液管把下層溶液移取到100 mL雞心瓶中，再用二氯甲烷10 mL再提取一次，合并提取液于同一雞心瓶中。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)控制水浴溫度40 ℃，最后剩下約1 mL，加入5 mL乙腈溶解清洗雞心瓶?jī)?nèi)壁。

安裝固相萃取裝置上端固相萃取小柱（中性氧化鋁）連接下端固相萃取小柱（PRS），先用純乙腈10 mL活化小柱，把雞心瓶中的溶液移取至其中，自然過(guò)濾，再用5 mL乙腈溶解清洗雞心瓶?jī)?nèi)壁，過(guò)固相萃取裝置，棄去廢液。洗耳球壓干，按順序準(zhǔn)確用2 mL流動(dòng)相、1 mL0.2%鹽酸羥胺甲醇溶液，洗脫下端PRS柱，收集洗脫液混勻過(guò)0.45 μm的微孔濾膜，待高效液相色譜測(cè)定。

1.6 液相色譜條件

FLD檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)：265 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：360 nm；色譜柱：kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-乙酸緩沖液（82+18）；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：50 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化優(yōu)化與提取選擇

水產(chǎn)品中主要以蛋白質(zhì)脂肪為主，脂肪含量較高。孔雀石綠具有很好的親脂性，容易附著在脂肪蛋白中，難以進(jìn)行目標(biāo)化合分析物的提取分離凈化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇了堿性氧化鋁、酸性氧化鋁、中性氧化鋁分離樣品中的脂肪蛋白質(zhì)雜質(zhì)，中性氧化鋁比酸性、堿性氧化鋁對(duì)蛋白質(zhì)脂肪的吸附較強(qiáng)。因此，前處理實(shí)驗(yàn)凈化過(guò)程中，選擇中性氧化鋁固相萃取柱凈化，消除油脂蛋白質(zhì)雜質(zhì)的基質(zhì)干擾，減少了對(duì)色譜柱和儀器的損害[5]。

此外，筆者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用乙腈（C?H?N）、乙酸鈉緩沖溶液（CH?COONa）、甲醇（CH?OH）和二氯甲烷（CH?Cl2）等作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物易溶于乙腈（C?H?N），且乙腈的提取效果最好，回收率為85.4%～91.8%，因此選擇乙腈作為提取劑，結(jié)果見表1。

表1 不同提取劑的效果情況表

2.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)研究了乙酸鈉水溶液-乙腈、乙酸銨水溶液-乙腈、四丁基溴化鈉-乙腈等不同流動(dòng)相對(duì)無(wú)色孔雀石綠（Leucomalachite Green，LMG）的分離效果。結(jié)果表明，以乙酸銨水溶液-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)可獲得更好的分離效果和響應(yīng)信號(hào)，從而得到好的回收率。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 不同流動(dòng)相的效果情況表

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍及檢出限測(cè)定

配 制 質(zhì) 量 濃 度 為 0 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和 20.0 ng·mL-1無(wú)色孔雀石綠LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度，按照1.4～1.6方法進(jìn)行測(cè)定。得到無(wú)色孔雀石綠濃度y（ng·L-1）與峰面積x的線性關(guān)系方程為y=0.315 7x+0.032 25，r2=0.999 98，表明無(wú)色孔雀石綠的線性關(guān)系良好。在蟹苗空白樣品中加標(biāo)濃度進(jìn)行測(cè)定，由儀器給出信噪比（S/N）=3求得檢測(cè)限為0.5 μg·kg-1，以出信噪比（S/N）=10 求得定量限為 1.6 μg·kg-1。

2.4 方法回收率和精密度

用陰性蟹苗樣品作為基質(zhì)，分別選擇兩種加標(biāo)濃度 2 μg·kg-1和 10 μg·kg-1進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，無(wú)色孔雀石綠LMG回收率為78.9%～101.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜10.0%，具體結(jié)果見表3。表明該方法操作穩(wěn)定、重復(fù)性好。

表3 回收率和精密度結(jié)果表

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)本地區(qū)育苗廠的蟹苗共20份樣品進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出無(wú)色孔雀石綠藥物，相關(guān)部門應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，保障水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)提取溶劑的選擇、凈化方式和流動(dòng)相的選擇等建立了一種測(cè)定蟹苗孔雀石綠、無(wú)色孔雀石綠物質(zhì)殘留的超高效液相色譜檢測(cè)方法，結(jié)果表明該方法具有更好的穩(wěn)定性、靈敏度、方法精密度高，無(wú)色孔雀石綠的回收率為78.9%～101.0%。