在線固相萃取-二維液相色譜法同時測定嬰幼兒配方奶粉中的維生素A、D和維生素E異構體含量

◎ 苗紀芳，劉興國，張 麗，張雪珂，金 燕，宗珊盈

（1.中檢集團中原農食產品檢測（河南）有限公司，河南 鄭州 450008；2.賽默飛世爾科技（中國）有限公司，北京 100080）

維生素是人和動物為維持正常生理功能而必須從食物中獲得的一種微量有機物質，根據不同的物理性質分為水溶性維生素和脂溶性維生素兩大類，其中脂溶性維生素A、D、E在人體的視覺能力、免疫功能、抗氧化和抗衰老能力等諸方面都有著重要的生理功能[1]。維生素缺乏會造成人體亞健康，因此對于維生素的補充越來越受到人們的重視。嬰幼兒及成人配方奶粉是脂溶性維生素強化的重要形式之一。

奶粉樣品基質復雜，我國和歐洲關于食品中維生素D的現行標準方法中，需采用正相模式的制備液相色譜、反相色譜兩套儀器分別進行凈化、制備和分析，分析效率很低[2-3]。本文在前期研究基礎上，優化色譜條件，采用在線固相萃取的方式代替傳統的液液萃取、蒸干和復溶的步驟，并結合二維液相，在一維色譜柱上分析維生素E異構體含量，維生素A、維生素D2和D3通過閥切換中心切割的方式轉移到二維色譜柱上進行含量分析[4-5]。一次進樣實現了這幾種常見脂溶性維生素的分析，同時也可以避免樣品基質對維生素A測定的干擾。

1 材料與方法

1.1 試劑與標準品

試劑：乙腈、甲醇、乙醇及異丙醇（色譜級，Fisher公司）；去離子水（18.2 MΩ，Millipore純水機）；氫氧化鉀、抗壞血酸、2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）和無水硫酸鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

標準品：維生素A（all-trans retinol，≥95%，Sigma-Aldrich）；維生素D2（98.1%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；維生素D3（99.6%，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；α-生育酚（α-tocopherol，98.0%，Sigma-Aldrich）；γ、δ-生育酚（≥96%，Sigma-Aldrich）。

1.2 儀器與色譜柱

Thermo Fisher Vanquish高效液相色譜儀：含兩個Viper Only 2p-6p切換閥，檢測器Vanquish Diode Array Detector HL（含10 mm光纖池）和U3000 VWD3100 Detector（含11 μL流通池）；樣品收集環體積：500 μL；色譜軟件：變色龍Chromeleon 7.3；在線SPE柱：PLRP-S（12.5 mm×4.6 mm）；一維色譜柱：VITADE-005K2（150 mm×3.0 mm，3.0 μm）；二維色譜柱：VITADE-004K1（100 mm×4.6 mm，2.6 μm）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準品溶液制備

分別精密稱量維生素A，D2、D3，α、γ和δ-生育酚標準品適量，至10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度分別為0.062 3 mg·mL-1、0.097 0 mg·mL-1、0.097 0 mg·mL-1、1.144 0 mg·mL-1、2.651 0 mg·mL-1和 2.062 0 mg·mL-1的標準品溶液。

標準混合溶液制備：分別精密量取上述維生素A，D2、D3，α、γ和δ-生育酚標準品溶液適量，至10 mL棕色容量瓶中，50%乙醇稀釋定容成濃度在以下范圍內的6個標準混合溶液（濃度范圍分 別 為 維 生 素 A 0.025～ 0.374 μg·mL-1，α- 維 生素 E 0.915～ 13.728 μg·mL-1、γ-維 生 素 E 2.121～21.211 μg·mL-1、δ- 維生素 E 1.649 ～ 24.740 μg·mL-1，維 生 素 D20.006 ～ 0.097 μg·mL-1、D30.006 ～0.097 μg·mL-1）。

1.3.2 供試品溶液制備

參考《食品安全國家標準 食品中維生素A、D、E的測定》（GB 5009.82—2016）[2]的方法，精密稱取固體奶粉試樣約5.00 g（精確到0.01 g）于150 mL平底燒瓶中，用約30 mL 45～50 ℃溫水使其溶解，混勻。加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT，混勻，再加入30 mL無水乙醇，充分混勻后，加入約20 mL 0.5 g·mL-1氫氧化鉀水溶液混勻，于80 ℃恒溫水浴振蕩、皂化約30 min。然后取出立刻用冷水冷卻至室溫，用50%乙醇水溶液轉移并定容到100 mL容量瓶中，混勻，高速離心約 5 min（＞ 5 000 r·min-1）后用 0.22 μm 針式過濾器過濾后上機分析。

1.3.3 色譜條件

流動相：SPE pump 以乙醇∶水=4∶6為流動相A，乙腈∶異丙醇=1∶1為流動相B；1D pump 以乙腈為流動相A，水為流動相B；2D pump A以乙腈為流動相A，甲醇為流動相B，水為流動相C；流速：SPE pump，0～11.0 min為1.0 mL·min-1、11.5～20.0 min為0.3 mL·min-1、20.5～32.0 min 為 1.0 mL·min-1；1D pump，0 ～ 32.0 min 為 0.8 mL·min-1；2D pump，0 ～ 32.0 min為 1.3 mL·min-1；進樣體積：100 μL；柱溫：30 ℃；檢測器條件：VWD采集波長，0～10.0 min為325 nm，10.0～32.0 min為296 nm；DAD采 集 波 長，0～32.0 min為264 nm。閥切換程序見表1，梯度洗脫條件見表2，儀器連接圖見圖1。

表1 閥切換程序表

表2 梯度洗脫條件表

圖1 儀器連接圖

2 結果與分析

2.1 樣品溶液測定圖譜

精密稱取市售某品牌嬰幼兒配方奶粉5.001 g，按照供試品溶液制備方法進行樣品制備，然后進液相色譜系統進行分析，維生素A、E、D測定色譜圖分別見圖2、圖3、圖4。

圖2 維生素A測定譜圖

圖3 維生素E測定譜圖（δ、γ和α-生育酚）

圖4 維生素D測定譜圖（該樣品中只含有維生素D3）

2.2 方法線性及定量限

按系列標準混合溶液配制方法配制不同濃度的混合標準液，進樣100 μL，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，考察方法的線性范圍及定量限。由表3可知，各化合物在其濃度范圍內線性良好，相關系數均＞0.999 0，方法靈敏度較高，維生素D3定量限滿足國家標準要求。

表3 線性及定量限結果表

2.3 回收率與精密度實驗

取市售某品牌配方奶粉樣品，等量加入標識含量的維生素A、α-維生素E和維生素D3，按供試品溶液制備方法進行樣品制備，測定各維生素含量，計算回收率。結果表明，維生素A回收率為106.4%、α-維生素E回收率為102.1%、維生素D3回收率為98.7%，方法回收率較好。取以下濃度維生素A 0.125 μg·mL-1，α，γ，δ- 維生素 E 分別為 4.575 μg·mL-1、10.605 μg·mL-1、8.245 μg·mL-1，維生素 D20.030 μg·mL-1和維生素 D30.030 μg·mL-1的混合標準品溶液，連續進樣6次。結果表明，維生素A峰面積的RSD為1.89%，α，γ，δ-VE峰面積的RSD分別為2.53%，1.64%和2.19%，維生素D2和維生素D3峰面積的RSD分別為0.96%、0.82%，方法精密度較好。

2.4 樣品測定結果

取市售某品牌配方奶粉樣品，分別按本方法與國標《食品安全國家標準 食品中維生素A、D、E的測定》（GB 5009.82—2016）方法進行樣品制備和測定，各維生素含量結果見表4。由表4可知，本方法相對國標方法的結果偏差小于5%。

表4 樣品中維生素含量測定結果表

3 結論

本方法基于賽默飛Vanquish液相色譜平臺搭建在線固相萃取-二維液相色譜，采用三泵兩個檢測器實現了皂化液稀釋后上樣進行維生素A、D、E異構體的同時測定，采用高靈敏度光纖池可以滿足低含量維生素D的檢測，方法提高了奶粉樣品中脂溶性維生素的分析效率，可應用于奶粉的日常檢測與評價。