體外培養(yǎng)細(xì)胞系與體內(nèi)血清蛋白質(zhì)N-糖基化的差異研究△

關(guān)麗芬，王俊妍，李煒煊，黃純翠，李巖,3#

1佛山市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東 佛山 528000

2中國科學(xué)院生物物理研究所交叉科學(xué)所重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100101

3中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049

蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要形式之一，作為生物信息分子參與并調(diào)控了多種關(guān)鍵生物過程，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1-2]。細(xì)胞發(fā)生惡變時，蛋白質(zhì)的糖基化合成會發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變。蛋白質(zhì)的唾液酸化、巖藻糖基化與致癌潛力和侵襲性的增加有關(guān)[3-4]，識別腫瘤亞型的蛋白質(zhì)糖基化表達(dá)可能在患者分層治療中具有潛在的應(yīng)用價值[5-6]。蛋白質(zhì)糖基化可影響腫瘤細(xì)胞的多個功能，包括促進(jìn)細(xì)胞黏附、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等，進(jìn)一步影響腫瘤微環(huán)境及免疫應(yīng)答[7]。對腫瘤細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或分泌蛋白質(zhì)的糖基化分析已廣泛應(yīng)用于腫瘤生物標(biāo)志物等研究領(lǐng)域。

蛋白質(zhì)的N-糖基化通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物共價連接到蛋白質(zhì)序列（N-X-S/T、X≠P）的天冬酰胺殘基上，隨后糖型被各種糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶修飾[8]。由于糖型合成不像蛋白質(zhì)和核酸那樣有DNA模板指導(dǎo)，因此，糖型結(jié)構(gòu)取決于糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的協(xié)同和競爭作用。目前，已經(jīng)被克隆的糖基酶有130余種，這些糖基酶在細(xì)胞內(nèi)的共同作用，產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)多樣的N-糖型，導(dǎo)致蛋白質(zhì)糖基化的異質(zhì)性。細(xì)胞中亞高爾基體定位和復(fù)合物形成等多種其他因素也參與了活性調(diào)節(jié)。因此，不同于基因與蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞外環(huán)境可能對蛋白質(zhì)糖基化造成了影響，導(dǎo)致表達(dá)水平與糖型結(jié)構(gòu)的改變，這可能是因為體內(nèi)和體外細(xì)胞培養(yǎng)的差異影響了糖型合成，提示應(yīng)注意區(qū)分體內(nèi)和體外表達(dá)的區(qū)別，更加準(zhǔn)確地進(jìn)行實(shí)驗設(shè)計與操作。

腸癌細(xì)胞系和腸癌組織中的蛋白質(zhì)具有多種糖基化表達(dá)，包括核心巖藻糖基化和N-乙酰葡糖胺增加等[9-10]，糖型結(jié)構(gòu)的多樣性與復(fù)雜性遠(yuǎn)超蛋白質(zhì)和核酸，進(jìn)行糖組學(xué)研究時需考慮到這些因素帶來的影響，這是糖生物學(xué)領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)。腸癌細(xì)胞系的體外培養(yǎng)是體外研究腸道功能和病理機(jī)制的重要工具。人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、HCT116、DLD等已被廣泛用于腸道研究中，考慮體外培養(yǎng)條件也會影響細(xì)胞蛋白質(zhì)糖基化的表達(dá)譜，培養(yǎng)基的葡萄糖濃度、pH值、藥物種類、氨離子濃度等也可能會影響蛋白質(zhì)糖基化。因此，為證實(shí)體內(nèi)和體外細(xì)胞培養(yǎng)對糖型合成的影響及影響程度，本研究采用人結(jié)腸癌細(xì)胞系與結(jié)腸癌患者血清，分別代表體外培養(yǎng)與體內(nèi)合成的兩種條件，進(jìn)行蛋白質(zhì)N-糖基化表達(dá)譜分析，探討糖基化表達(dá)在體外與體內(nèi)的差異，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1—6月佛山市第一人民醫(yī)院收治的結(jié)腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)和病理學(xué)檢查確診為結(jié)腸癌；②理解和溝通能力正常；③病歷及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①依從性較差；②合并其他嚴(yán)重心、肝、腎等疾病；③合并其他消化系統(tǒng)疾病或腫瘤；④存在精神疾病，不能正常溝通交流。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入10例結(jié)腸癌患者，其中男5例，女5例；年齡55～77歲，平均（66.10±6.67）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、RKO、DLD均購自上海中科院細(xì)胞庫。二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、高純度無水二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購自美國Sigma公司，肽N-糖苷酶F（peptide-N-glycosidase F，PNGase F）購自美國New England BioLabs公司，氫氧化鈉、碘甲烷均購自國藥集團(tuán)有限公司，甲醇、乙腈（acetonitrile，ACN）（質(zhì)譜級）均購自美國J.T.Baker公司，2，5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）購自美國 ProteoChem公司。Oasis C18柱、Sep-Pak C18柱均購自美國Waters公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 樣本預(yù)處理結(jié)腸癌組患者入院時抽取清晨空腹外周靜脈血4 ml，3000 r/min離心15 min，收集血清，-80℃保存待測。將人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、RKO、DLD 離心 5 min，1000 r/min，棄上清，下層沉淀保存待檢。

1.3.2 N-糖提取與分離純化向血清和細(xì)胞樣本中加入DTT、IAA，超濾后使用胰蛋白酶水解；過Oasis C18柱，獲取糖肽；加入PNGase F過夜，過Sep-Pak C18柱，獲取N-糖型。

1.3.3 N-糖的甲基化使用氫氧化鈉、DMSO和碘甲烷對N-糖型進(jìn)行甲基化反應(yīng)。甲基化的N-糖型溶于50%甲醇中并通過Sep-Pak C18柱，使用ACN水溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液進(jìn)行濃縮凍干。

1.3.4 N-糖的質(zhì)譜檢測將甲基化后的N-糖鏈溶于20 μl甲醇中，按照N-糖與DHB基質(zhì)溶液（10 mg/ml，50%甲醇）1∶1混合，點(diǎn)在MALDI靶板（900 μm，384孔板）上，在室溫條件下自然風(fēng)干。用標(biāo)肽對MALDI-QIT-TOF-MSn進(jìn)行校正，在20 kV加速電壓的作用下，使用正離子模式的Axima MALDI Resonance質(zhì)譜儀對樣品進(jìn)行分析，用波長為337 nm的氮?dú)饧す廨椪諛悠罚芰繛?20，獲取1000～4000 Da質(zhì)量范圍內(nèi)的一級質(zhì)譜。二級質(zhì)譜和三級質(zhì)譜的能量分別為300和450。

1.4 N-糖結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用GlycoWorkbench軟件中的CFG,Carbbank,Glycome DB,and Glycosciences數(shù)據(jù)庫對N-糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、RKO、DLD的N-糖組圖譜

對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的分析發(fā)現(xiàn)，HCT116細(xì)胞系中共有12個N-糖型，其中高甘露糖型2個，其余10個為復(fù)合型糖，大部分含有唾液酸和核心巖藻糖，多為雙天線、三天線（圖1）。對結(jié)腸癌細(xì)胞RKO的分析發(fā)現(xiàn)，RKO細(xì)胞N-糖型中有6個高甘露糖型，9個復(fù)合型糖，半乳糖含量較高，還發(fā)現(xiàn)了存在少量核心巖藻糖和羥乙酰神經(jīng)氨酸，多為三天線糖型（圖2）。對結(jié)腸癌細(xì)胞DLD的分析發(fā)現(xiàn)，DLD細(xì)胞N-糖型中有4個高甘露糖型，8個復(fù)合型糖，其中半乳糖含量較高，不存在核心巖藻糖和羥乙酰神經(jīng)氨酸，多為三天線糖型（圖3）。與結(jié)腸癌細(xì)胞RKO比較，結(jié)腸癌細(xì)胞DLD的N-糖型構(gòu)成較為簡單，結(jié)腸癌細(xì)胞RKO涵蓋了DLD細(xì)胞的全部糖型。結(jié)腸癌細(xì)胞RKO、DLD與HCT116存在較為明顯的差異，其中結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的N-糖型多以雙天線、三天線為主，唾液酸和核心巖藻糖含量較高；而結(jié)腸癌細(xì)胞RKO、DLD的N-糖型多為三天線，半乳糖含量較高。

圖1 結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的N-糖組圖譜

圖2 結(jié)腸癌細(xì)胞RKO的N-糖組圖譜

圖3 結(jié)腸癌細(xì)胞DLD的N-糖組圖譜

2.2 結(jié)腸癌患者血清中N-糖組分析

結(jié)腸癌患者血清中含有1個高甘露糖型和12個復(fù)合糖型，且多為雙天線，少數(shù)為三天線，多數(shù)糖型含有核心巖藻糖和羥乙酰神經(jīng)氨酸，部分支鏈上含有巖藻糖，與結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、RKO、DLD的N-糖型組構(gòu)成存在明顯的區(qū)別。（圖4）

圖4 結(jié)腸癌患者血清N-糖組圖譜

2.3 結(jié)腸癌細(xì)胞與結(jié)腸癌患者血清N-糖基化分析

結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116含核心巖藻糖較多，結(jié)腸癌細(xì)胞RKO和DLD中高甘露糖型較多，結(jié)腸癌患者血清中含核心巖藻糖和唾液酸較多一些。結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、結(jié)腸癌患者血清以雙天線糖型為主，而結(jié)腸癌細(xì)胞RKO、DLD以三天線糖型為主。（表1）

表1 根據(jù)糖型和結(jié)構(gòu)類型對腸癌細(xì)胞HCT116、RKO、DLD及結(jié)腸癌患者血清中N-糖型進(jìn)行分類

3 討論

尋找無創(chuàng)、特異度高、價格便宜的腫瘤生物標(biāo)志物是臨床研究的重點(diǎn)。目前，蛋白質(zhì)糖基化表達(dá)對腫瘤類型和進(jìn)展程度具有特異性，因此，蛋白質(zhì)糖基化可能成為潛在的腫瘤生物標(biāo)志物及藥物治療靶點(diǎn)。由于部分腫瘤樣本的獲得困難，樣本量少，限制了蛋白質(zhì)糖基化在臨床中的研究及應(yīng)用。因此，在腸癌蛋白質(zhì)糖基化研究過程中，可選擇細(xì)胞代替。為使研究具有較好的臨床相關(guān)性，進(jìn)一步評估結(jié)腸癌細(xì)胞系作為疾病模型的潛力，比較體外細(xì)胞和體內(nèi)血清的蛋白質(zhì)糖基化譜非常必要。

Holst等[11]的研究顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116與其他檢測細(xì)胞系的N-糖圖譜有很大不同。因此，本研究選取了3個典型的結(jié)腸癌細(xì)胞系，即HCT116、RKO、DLD，以及結(jié)腸癌患者血清進(jìn)行比較。上述實(shí)驗結(jié)果顯示，與體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、RKO、DLD相比，結(jié)腸癌患者血清蛋白質(zhì)N-糖基化表達(dá)中高甘露糖型較少，多為雙天線復(fù)合型糖，不含平分型，與結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116存在一定相似性，而與結(jié)腸癌細(xì)胞RKO、DLD差異較大，結(jié)腸癌細(xì)胞RKO、DLD中高甘露糖型占比較大，多為三天線糖型，含唾液酸和核心巖藻糖較少。結(jié)腸癌細(xì)胞RKO、DLD和結(jié)腸癌患者血清N-聚糖譜間的主要區(qū)別是高甘露糖型在多數(shù)細(xì)胞中占主導(dǎo)地位。從生物合成的角度來看，結(jié)腸癌細(xì)胞RKO、DLD中高甘露糖型較多，表明N-聚糖的加工不完全，這可能是由于細(xì)胞分裂/復(fù)制時間較短[12]。由于腫瘤異質(zhì)性很難在單個細(xì)胞系中表現(xiàn)出來，因此，體外培養(yǎng)的腸癌細(xì)胞系并不能完全代替體內(nèi)血清蛋白質(zhì)糖基化譜，且不同細(xì)胞系在N-糖基化方面存在明顯差異。如果利用單一結(jié)腸癌細(xì)胞系模型研究結(jié)腸癌患者的N-糖基化譜，可能會對腸癌糖生物學(xué)發(fā)現(xiàn)進(jìn)行錯誤概括，在構(gòu)建體外細(xì)胞模型篩選生物標(biāo)志物時一定要考慮到這個問題。由此可見體外結(jié)腸癌細(xì)胞模型在臨床研究中的局限性。為選擇最佳的疾病模型，需要進(jìn)行更大規(guī)模的研究，將細(xì)胞系糖基化與患者血清來源的聚糖譜進(jìn)行比較，研究不同組合的細(xì)胞系可能有助于更好地模擬腫瘤的聚糖譜。臨床研究中優(yōu)先考慮使用患者的組織樣本和血清樣本；當(dāng)臨床樣本來源受限時，并且單純考慮與體內(nèi)糖型相似度這個因素時，HCT116細(xì)胞系比RKO、DLD細(xì)胞系更適合用于結(jié)腸癌研究。

本研究3種結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、RKO、DLD的蛋白質(zhì)糖基化表達(dá)譜也有區(qū)別，可能與細(xì)胞來源、培養(yǎng)條件有關(guān)，比如血清的選擇、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基的選擇等，這些條件都會影響糖型表達(dá)。Zhou等[13]的研究表明，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，小分子培養(yǎng)基添加劑會影響免疫球蛋白G的N-糖的糖基化水平，而牛血清白蛋白作為培養(yǎng)基添加劑顯著改變了免疫球蛋白G的N-糖型。在進(jìn)行蛋白質(zhì)糖基化研究時要考慮這些因素，以避免外部因素干擾。值得注意的是，本研究在利用細(xì)胞系作為疾病研究模型時，還需要考慮細(xì)胞全糖、細(xì)胞表面糖、各細(xì)胞器糖與原發(fā)性腫瘤及轉(zhuǎn)移瘤特征的關(guān)聯(lián)。

在腸癌等生物標(biāo)志物與藥物研發(fā)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)糖基化已被證明是重要的研究內(nèi)容，用于新型診斷性生物標(biāo)志物（用于疾病檢測、臨床分期或風(fēng)險分層）、預(yù)測性生物標(biāo)志物（用于預(yù)測患者對治療的反應(yīng)）和預(yù)后生物標(biāo)志物（用于評估疾病的可能發(fā)展方式）的開發(fā)，將對疾病診療策略有重要意義。

綜上所述，結(jié)腸癌患者血清蛋白質(zhì)N-糖圖譜與結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116存在一定相似性，而與結(jié)腸癌細(xì)胞RKO、DLD差異較大。體外培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白質(zhì)N-糖基化，與體內(nèi)細(xì)胞的蛋白質(zhì)N-糖基化表達(dá)并不完全一致。