龜齡集指紋圖譜的建立及共有峰的LC-MS鑒定

史靜超 ，高曉霞 ，張愛榮 ，秦雪梅 *

（1.山西中醫藥大學 中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619；2.山西大學 中醫藥現代研究中心，山西 太原 030006；3.山西廣譽遠國藥有限公司，山西 太谷 030800）

0 引言

龜齡集是我國傳統中藥名方，始于明代嘉靖年間，歷經400多年傳承而不衰。2020版《中國藥典》記載該方由紅參、鹿茸、海馬、補骨脂、甘草、天冬、淫羊藿等二十余味藥材加工制成，具有強身補腦，固腎補氣，增進食欲之功效［1］?，F代藥理和臨床研究表明龜齡集可改善衰老引起的學習記憶功能障礙［2-3］，并可改善腎陽虛證［4］，對睪丸功能障礙具有保護作用［5-6］。

龜齡集的多種功效源于其物質基礎，龜齡集組方由二十余味藥材經炮制、升煉而成，藥味多、生產工藝復雜，這都增加了龜齡集質量控制的難度。近年來，中藥復方指紋圖譜因其能夠獲得多維化學信息，并可得到標志復方特征的共有峰，而在中藥復方質量控制方面應用廣泛［7］。龜齡集產品一致性如何，怎樣評價龜齡集產品的一致性和生產工藝的穩定性，目前尚無相關研究?；诖?，本研究采用UPLC法對龜齡集進行測定，建立了龜齡集的UPLC指紋圖譜，并對收集的15批次龜齡集樣本進行了相似度評價。同時，采用LC-MS技術對龜齡集UPLC指紋圖譜共有峰進行鑒定，以期為龜齡集質量控制提供科學依據。

1 儀器與材料

Waters ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜系統（美國Waters公司），UHPLC-Q Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（美國Thermo公司），Milli-Q Advantage純水-超純水制備系統（美國Millipore公司）。

龜齡集（S1～S15批號依次為：20130201、20130302、 20141112、 20150101、 20150507、20151212、 103160203、 103160407、 103160508、103160917、103161018、 103170305、103170408、103170510、103170714，山西廣譽遠國藥集團有限公司），補骨脂素（≥98%，批號：MUST-16092810）、新補骨脂異黃酮（≥98%，批號：MUST-16092810）和齊墩果酸（≥98%，批號：MUST-17042706）均購于成都曼斯特生物科技有限公司，甲醇、石油醚（60℃～ 90℃）為分析純，乙腈為色譜純。

2 研究方法

2.1 色譜和質譜條件

色譜條件：采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm；1.8 μm）色譜柱，流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；體積流量0.3 mL/min；進樣體積2 μL；檢測波長203 nm；柱溫30℃。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution process

質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），正負離子全掃模式，設置掃描質量范圍為100 Da～1 500 Da，質量分辨率70 000，毛細管溫度為320℃，加熱器溫度為300℃，鞘氣流速為35 arb，輔氣流速為10 arb，碰撞能量為25 V～60 V，采用快速數據依賴采集模式（DDA），對離子強度大于5 000的前驅離子進行MS/MS采集。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試樣品制備

精密稱取龜齡集樣品1.0 g，置錐形瓶中加50 mL甲醇，超聲提取30 min，將得到的溶液過濾，并將濾液濃縮至干，加30 mL水溶解殘渣，以10 mL石油醚萃取3次，合并萃取液并濃縮至干，將殘渣置2 mL容量瓶，以色譜甲醇溶解并定容，再用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.2.2 對照品溶液制備

取適量補骨脂素、新補骨脂異黃酮、齊墩果酸，以色譜甲醇溶解，并定容至2 mL容量瓶，再用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取同一批次龜齡集供試樣品，按“2.1項”色譜條件連續進樣6次，以11號峰為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD＜0.13%，相對峰面積RSD＜1.53%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

取同一批次龜齡集共6份，按照“2.2項”供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1項”色譜條件進行測定，以11號峰為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD＜0.10%，相對峰面積RSD＜1.02%，表明該方法的重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗

取同一龜齡集供試品溶液，按“2.2項”供試品制備方法制備供試品溶液，分別于0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，24 h按“2.1項”色譜條件進行測定，以11號峰為參照峰，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD＜ 0.15%，相對峰面積RSD＜ 1.78%，表明供試品溶液在24 h內具有良好的穩定性。

3 研究結果

3.1 龜齡集UPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

3.1.1 指紋圖譜的建立

按照“2.2項”的方法制備15批龜齡集供試品溶液，按“2.1項”色譜條件測定，記錄每批龜齡集的UPLC圖譜。15批樣品各主要色譜峰保留時間基本一致，確定了該檢測條件下峰面積較大、分離較好的19個峰為其共有色譜峰。其中11號峰與相鄰峰分離良好，峰面積大且穩定性好，將其作為參照峰。將測得的15批樣品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》進行分析，得到共有模式對照指紋圖譜R，如圖1。

圖1 龜齡集UPLC對照指紋圖譜RFig.1 UPLC fingerprints of control fingerprint（R）

3.1.2 相似度評價

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對15批樣品進行相似度評價，15批龜齡集UPLC指紋圖譜疊加圖見圖2，15批樣品及對照指紋圖譜R的相似度計算結果見表2。由結果可知15批龜齡集樣本間相似度大于0.820，和對照指紋圖譜相似度均大于0.932，說明龜齡集產品生產工藝穩定，一致性良好。

圖2 15批龜齡集樣品UPLC指紋圖譜疊加圖Fig.2 UPLC fingerprints of 15 batches of Guilingji samples

表2 龜齡集指紋圖譜相似度評價結果Table 2 Similarity evaluation on whole plant of Guilingji

3.2 龜齡集UPLC指紋圖譜共有峰LC-MS鑒定

將供試品溶液按照“2.1”項下色譜和質譜條件進行測試。正負離子模式下的龜齡集樣品和混合對照品的總離子流圖見圖3。采用Xcalibur 3.2軟件分析得到的質譜數據，計算各共有峰對應化合物可能的化學式，并參照文獻精確分子量和碎片離子鑒定了12個共有峰，其中1、3、13號峰經和對照品比對保留時間、精密分子量和碎片離子鑒定得到，鑒定結果見表3。

圖3 正離子模式下龜齡集總離子流圖（a），負離子模式下龜齡集總離子流圖（b）和混合對照總離子流圖（c）Fig.3 Total ion chromatograms(TIC)of Guilingji in positive mode(a);the total ion chromatograms(TIC)of Guilingji in negative(b),and the total ion chromatograms(TIC)of mixed references(c)

表3 龜齡集UPLC共有峰LC-MS化學成分鑒定Table 3 Identification of common peaks of Guilingji by LC-MS

4 分析與討論

4.1 提取條件及色譜條件優化

由于龜齡集復方組成藥味繁多，化學成分復雜多樣，使得液相色譜中各峰的分離度差且峰面積小，為獲得較多的化學信息和更好的分離度，實驗考察了多種提取條件，包括100%甲醇、75%甲醇、50%甲醇、100%水回流、超聲提取，發現峰分離較差，可能是由于龜齡集組方藥味繁多，化學成分復雜導致峰重疊嚴重，故將甲醇提取物進行萃取，使用不同極性溶劑，包括石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，通過對比各種提取條件下UPLC圖譜中總峰面積、總峰數和峰分離度，選擇甲醇超聲提取后再用石油醚萃取的條件。色譜條件優化了流動相系統及洗脫梯度，還考察了柱溫包括25℃、30℃、35℃、40℃，發現在是用乙腈-水系統得到的峰更多，柱溫在30℃時各峰對稱性和分離度較好。采用光二極管陣列全波長掃描模式考察不同檢測波長下的總峰數和峰面積，發現在203 nm處的峰數多且各峰均有較好的吸收。

4.2 龜齡集產品一致性和生產工藝穩定性評價

本研究建立的龜齡集UPLC指紋圖譜，確定了19個共有峰，并計算了15批龜齡集產品的相似度，結果表明各批次樣品相似度良好，雖然龜齡集制作工藝復雜，需將各單味藥材經炮制再打粉混勻而后升煉制成，但其生產工藝穩定，產品一致性好。龜齡集UPLC指紋圖譜共有峰LC-MS鑒定結果表明該指紋圖譜中主要包括黃酮、香豆素、三萜和甾體類化合物。其中黃酮類化合物如新補骨脂異黃酮和corylifol A有良好的抗炎、抗氧化作用［13］，甘草查耳酮A亦可發揮抗炎和抗氧化的作用，其可能的機制是抑制NF-κB的激活和清除體外超氧陰離子自由基［14］。且黃酮類化合物可通過與大腦中負責記憶的細胞和分子相互作用來減少由于神經退行性過程造成的神經元損失，改善與年齡相關的認知障礙［15］。香豆素類化合物如補骨脂素、異補骨脂素也有良好的抗炎、抗氧化作用［13］，三萜類化合物如齊墩果酸可通過抗氧化、抗炎機制產生神經保護作用，并能抑制腦內11β-HSD1活性和β淀粉樣肽的形成改善學習記憶障礙［16］。甾體類化合物如薯蕷皂苷元可通過改善氧化應激作用，降低Tau蛋白異常磷酸化等作用改善老年性認知功能障礙［17］。正是龜齡集組方中二十余味藥材所含的化學成分協同作用才使得龜齡集具有強身補腦，固腎補氣等多種功效。

綜上，本研究首次建立了龜齡集UPLC指紋圖譜，該方法簡便、穩定、結果可靠，可用于龜齡集產品的一致性和生產工藝穩定性評價。同時，本研究建立的指紋圖譜為龜齡集甲醇提取物的石油醚萃取部位，由LC-MS共有峰鑒定結果可知該指紋圖譜主要反映龜齡集中所含的中、低極性成分，下一步研究還將針對龜齡集中高極性成分建立指紋圖譜，以全面反映龜齡集化學組成，從而保證臨床用藥的安全性和有效性。