白藜蘆醇通過PI3K/AKT信號通路抑制脂多糖誘導的人牙齦成纖維細胞炎癥

王玉嬌，李思玉，李俊雄，陳虹君 ，馮敬哲，邱亞 ，李麗華

(1.川北醫學院口腔醫學系；川北醫學院附屬醫院，2.醫學研究中心，3.口腔科，四川 南充 637000)

慢性牙周炎，是口腔最常見的疾病之一，也是目前成年人牙齒脫落的主要原因[1]，主要表現為齦下菌斑中的病原菌(例如牙齦卟啉單胞菌)導致的慢性炎癥，會導致軟組織的破壞，牙槽骨的吸收及牙齒的脫落[2]。牙周炎發病機理不清楚，防治難度較大，目前，中藥或中藥成分已經在包括牙周炎在內的難治性疾病中進行嘗試，以期找到新的治療策略。

牙齦卟啉單胞菌能夠通過脂多糖及其產生的炎性細胞因子刺激宿主免疫反應[3]，其中促炎細胞因子白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)已被證明是導致牙周組織破壞的重要的細胞因子[4-5]。人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts，HGFs)主要存在于牙齦結締組織中，在牙周組織的形成、再生、功能行使和修復中起著重要的作用[6]，不僅有較強的自我更新能力，而且有合成和降解膠原蛋白、彈力纖維等細胞外基質的功能[7]，由免疫細胞分泌的免疫因子調控，同時也會產生參與局部炎癥的細胞因子[8-9]。因此，抑制炎癥對慢性牙周炎治療至關重要。

白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一種安全有效的抗牙周炎的天然多酚植物抗毒素，具有抗氧化、抗癌、抗炎等生物活性[10-12]，可通過下調toll樣受體(toll-like receptor，TLR)信號改善糖尿病老鼠的實驗性牙周炎和抑制牙齦上皮細胞受脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后炎癥[13]。但是，RSV在LPS刺激的體外人牙齦成纖維細胞中的功能和機制尚未明確，尤其是促進健康作用的基本模式仍待探討。PI3K/AKT 信號通路主要由胞內磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)組成，在細胞增殖、凋亡、腫瘤發生和轉移以及癌癥擴散中發揮關鍵作用，與慢性牙周炎及其他慢性炎癥性疾病的發展相關[14]。因此，本研究擬探討RSV如何通過PI3K/AKT信號通路在LPS刺激的人牙齦成纖維細胞中發揮抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 白藜蘆醇(美國Sigma公司)；人牙齦成纖維細胞株 (上海佳和科技生物有限公司)；Dulbecco改良Eagle培養基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培養基(武漢普諾賽公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(素爾生物科技有限公司)；放射免疫沉淀法裂解緩沖液(radio immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA)(南京海克爾生物科技有限公司)；二苯二酚酸(bicinchonininc acid，BCA)試劑盒(上海易色醫療科技有限公司)；PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT抗體(美國Abcam公司)；β-actin抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(北京全式金生物技術有限公司)；LY294002(美國 Sigma 公司)；增強型化學發光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)化學發光底物試劑盒(廣州賽國生物科技有限責任公司)；IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.2 儀器 蛋白電泳設備(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(美國Thermo Fisher公司)；細胞培養箱(美國Thermo Fisher公司)；酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；臺式低溫離心機(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和處理 將人牙齦成纖維細胞株傳代培養5代，制備成4.0×104個/mL的細胞懸浮液，恒溫箱過夜。取等量人牙齦成纖維細胞懸浮液接種于6孔板上培養，直到融合至約80%，加入含有FBS的DMEM 培養基繼續培養。

1.2.2 細胞毒性分析 人牙齦成纖維細胞以5×103細胞/孔接種于96孔板內培養。設置空白對照組、RSV組、LPS組、LPS+RSV組。對照組：不做任何處理。LPS刺激組：加入牙齦卟啉單胞菌 LPS (1 μg/mL)；RSV-80 μmol/L組：加入RSV(80 μmol/L)；LPS+RSV組：加入牙齦卟啉單胞菌 LPS (1 μg/mL)和RSV(80 μmol/L)；繼續培養24 h。RSV的濃度參考既往研究[15-16]。然后以10∶1的比例用DMEM 培養基稀釋 CCK-8 試劑，并在每孔加入100 μL上述稀釋液，輕輕敲擊培養板混勻，在37 ℃的CO2孵箱中再培養2.5 h。 人牙齦成纖維細胞的生存能力通過細胞計數試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)測定，具體方法參照說明書。通過利用酶標儀檢測各組在450 nm處的吸光度從而獲得各組的細胞活力。該試驗重復4次。

1.2.3 酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 人牙齦成纖維細胞接種于24孔板，密度為2×105/孔。實驗一：設置空白對照組、LPS組、LPS+RSV組。對照組：不做任何處理。LPS刺激組：加入牙齦卟啉單胞菌 LPS (1 μg/mL)；LPS+RSV組：加入牙齦卟啉單胞菌 LPS (1 μg/mL)和RSV(80 μmol/L)；繼續培養30 min。實驗二：設置空白對照組、LPS組、LPS+RSV組、LPS+RSV+LY294002組。對照組：不做任何處理。LPS刺激組：加入牙齦卟啉單胞菌 LPS (1 μg/mL)；LPS+RSV組：加入牙齦卟啉單胞菌 LPS (1 μg/mL)和RSV(80 μmol/L)；LPS+RSV+LY294002組：加入RSV(80 μmol/L)和PI3K/AKT信號通路抑制劑(LY294002)，繼續培養24 h。各組細胞培養上清液中IL-1β、 IL-6、IL-8、TNF-α的含量用 ELISA試劑盒測定，具體方法參照說明書。然后將培養板用磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌5次，每孔加入50 μL生物素化抗體工作液，置于37 ℃持續 20 min。如前述洗滌后每孔加入100 μL 洗滌酶結合工作液置于37 ℃持續10 min。而后每孔加入100 μL底物顯色溶液，置于37 ℃避光持續 15 min后，每孔加100 μL停止液。吸光光度值在450 nm和570 nm的將被酶標儀測定。平行試驗3次。

1.2.4 Western Blot分析蛋白表達水平 人牙齦成纖維細胞以1×106細胞/孔接種于6孔板上培養。實驗一：設置空白對照組、LPS組、LPS+RSV組。對照組：不做任何處理。LPS刺激組：加入牙齦卟啉單胞菌 LPS (1 μg/mL)；LPS+RSV組：加入牙齦卟啉單胞菌 LPS (1 μg/mL)和RSV(80 μmol/L)；繼續培養30 min。實驗二：設置空白對照組、LPS組、LPS+RSV組、LPS+RSV+LY294002組。對照組：不做任何處理。LPS刺激組：加入牙齦卟啉單胞菌 LPS (1 μg/mL)；LPS+RSV組：加入牙齦卟啉單胞菌 LPS (1 μg/mL)和RSV(80 μmol/L)；LPS+RSV+LY294002組：加入RSV(80 μmol/L)和PI3K/AKT信號通路抑制劑(LY294002)，繼續培養30 min。然后分組收集細胞，進行Western blot實驗分析PI3K/AKT信號通路激活情況。細胞裂解產物用PBS洗滌3次再添加1%苯甲基磺酰氟的RIPA緩沖液中以裂解得到蛋白質。BCA測定試劑盒用于測定蛋白質濃度。在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中，在每個通道上裝載等量的蛋白質(40 μg)，并與分子量標準marker一起電泳。隨后，將這些蛋白質轉移到聚偏氟乙烯[poly(1,1-difluoroethylene)，PVDF]膜上，電流300 mA持續110 min。用10%脫脂奶粉封閉膜1 h并與相應的蛋白抗體或兔抗β-actin單克隆抗體孵育。然后把膜放在HRP山羊抗兔IgG中孵育。用凝膠圖像處理系統分析光密度。隨后，使用ECL系統對蛋白質條帶進行可視化處理，β-actin作為負載對照。以β-actin為細胞總蛋白內參，計算各組蛋白質的相對表達量。試驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 RSV對牙齦卟啉單胞菌LPS刺激的人牙齦成纖維細胞活力的影響

LPS刺激組、RSV-80 μmol/L組和LPS+RSV組處理人牙齦成纖維細胞，對細胞活力的影響與對照組相當，表明RSV對人牙齦成纖維細胞無毒性，并且作用方式為非特異性。見圖1。

2.2 RSV抑制牙齦卟啉單胞菌LPS誘導的人牙齦成纖維細胞的炎癥

LPS刺激導致人牙齦成纖維細胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α增加；在LPS刺激的人牙齦成纖維細胞中，80 μmol/L的RSV抑制了促炎因子IL-1β、 IL-6、 IL-8和TNF-α的產生，組間比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 RSV抑制牙齦卟啉單胞菌LPS誘導下PI3K/AKT 信號通路的激活

在人牙齦成纖維細胞中，LPS刺激組p-PI3K和p-AKT表達水平均高于對照組(P<0.05)。80 μmol/L RSV處理LPS刺激的人牙齦成纖維細胞后，PI3K和AKT的磷酸化水平降低，然而PI3K和AKT的表達在3組中的差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.4 RSV通過PI3K/AKT 信號通路抑制炎癥反應

在LPS+RSV+LY294002組中，LY294002進一步降低了PI3K和 AKT的磷酸化水平。ELISA結果顯示80 μmol/L RSV導致IL-1β、 IL-6、IL-8 和 TNF-α表達下降。這一效應被LY294002增強，即在LPS+RSV+LY294002組，PI3K/AKT信號通路的抑制進一步降低了這些細胞因子水平。這些結果表明在LPS刺激的人牙齦成纖維細胞中，RSV通過抑制PI3K/AKT信號通路來抑制炎癥反應。見圖4及圖5。

3 討論

臨床上牙周治療主要通過潔治術、刮治術、根面平整術清除附著的牙菌斑，偶爾輔用抗生素以控制口腔微生物的形成。天然藥物(中藥)的有效成分低毒、高效，可抑制細菌耐藥和感染，對慢性牙周炎治療有益[17]。本研究中，RSV抑制促炎因子 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達進而調控LPS誘導的人牙齦成纖維細胞炎癥反應。此外，本研究揭示了RSV通過抑制PI3K/AKT信號通路進而調節炎癥反應。

RSV是一種含有對稱二苯代乙烯結構的非黃酮類多酚化合物，隸屬于非甾體類天然抗氧化劑，可從葡萄皮、漿果和花生中提取，具有多種生物活性和藥理作用，其中抗炎作用已被廣泛驗證[18]。Park等[19]指出，RSV通過抑制 NF-κN 在白細胞中的激活，從而抑制脂多糖介導的內皮細胞粘附分子的表達和血管炎癥。RSV和水飛薊素的結合能夠顯著增強成纖維細胞的生存能力，并且RSV能抑制LPS介導的IL-6和IL-8表達[20]。RSV能減弱金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和牙齦卟啉單胞菌的增長和毒力因子的表達[21]。在實驗性牙周炎大鼠模型中，RSV導致了牙槽骨再吸收和降低IL-17表達[22]。RSV還可通過SIRT1/FOXO3A 信號通路和UNX2基因的表達有效促進骨生成[23]。本研究證明RSV處理對于人牙齦成纖維細胞的生存能力沒有明顯影響，并且能夠抑制LPS導致的人牙齦成纖維細胞中IL-1β、 IL-6、IL-8和TNF-α的升高，與前人研究結論相符合。

Tsai等[24]表明RSV通過阻斷 PI3K/AKT信號通路抑制癌細胞的增殖和侵襲。PI3K/AKT信號通路是牙周炎治療的關鍵介質。在牙齦上皮細胞中，牙齦卟啉單胞菌通過調節PI3K、AKT以及AKT 下游蛋白質 GSK3、mTOR和Bad的磷酸化水平，影響細胞存活和免疫反應[25]。牙齦卟啉單胞菌的LPS可通過 PI3K/AKT信號通路介導人牙齦成纖維細胞的自吞噬[26]。此外，大車前苷、咖啡酸苯乙基酯、杜鵑素等均能通過PI3K/AKT信號通路來抑制LPS刺激人牙齦成纖維細胞產生的炎癥反應[27]。在實驗性牙周病模型中，甲磺雙環脲通過下調PI3K和AKT降低髓過氧物酶活性和MDA、 IL-1β和 TNF-α 的水平[28]。本研究結果也表明LPS能夠刺激人牙齦成纖維細胞中PI3K/AKT 信號通路的激活，而RSV可抑制PI3K/AKT 信號通路的激活，PI3K/AKT 信號通路抑制劑(LY294002) 處理后，進一步降低了IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達，提示RSV通過抑制PI3K/AKT 信號通路來減輕炎癥傷害。

綜上所述，在牙齦卟啉單胞菌LPS誘導的人牙齦成纖維細胞炎癥中，RSV通過抑制PI3K/AKT 信號通路激活，降低炎癥因子水平，為牙周炎的治療提供了理論依據及新的方向。