負(fù)載抗菌肽的聚乳酸紡絲纖維體外藥物緩釋性能及抗菌性研究

謝寧，李慧，孫蕓蕓，張晗，朱憲春

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

阻生齒指已過(guò)萌出期卻在頜骨組織中未萌出的牙齒，上頜前牙阻生對(duì)面部美觀的影響較大且會(huì)影響咀嚼功能，這對(duì)患者的生活和心理健康等會(huì)造成負(fù)面影響[1]。目前，治療上頜骨內(nèi)埋伏阻生齒最常用的方法是正畸-外科聯(lián)合治療[2]。而對(duì)于阻生位置較深的患者，需先行開窗減壓術(shù)來(lái)消除囊性病變，待其經(jīng)術(shù)前設(shè)計(jì)的萌出通道自行萌出一段距離后再行助萌術(shù)[3]。同時(shí)，聚乳酸(PLLA)常被作為聚合物的基質(zhì)或藥物載體等用于臨床實(shí)踐中[4]。并且，熔融紡絲技術(shù)是目前制備PLLA纖維最常用且較簡(jiǎn)便的方法[5]，但作為一種植入材料，它疏水和非極性的表面特性不利于細(xì)胞黏附，且它本身并不具備抗菌性能，故需對(duì)其進(jìn)行表面改性[6]。而抗菌肽(AMPs)具備較好的抗菌活性，可用于臨床治療[7]。其次，HHC-36因其最低抑菌濃度(MIC)比抗生素低，細(xì)胞毒性和最低紅細(xì)胞溶解度也非常低[8]，故可用于制備植入物涂層。本研究擬利用聚多巴胺(PDA)輔助抗菌肽結(jié)合至PLLA纖維制備一種具有持續(xù)穩(wěn)定抗菌效果的改性材料，并研究其抗菌性及促細(xì)胞增殖潛能，以構(gòu)建理想的創(chuàng)口填充材料。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

聚乳酸原材料(長(zhǎng)春圣博瑪生物公司)，抗菌肽(HHC-36，KRWWKWWRR，95%純度，上海強(qiáng)耀生物公司)，丙酮(美國(guó)Sigma公司，179124)，無(wú)水乙醇(美國(guó)Sigma公司，459828)，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(美國(guó)Sigma公司，159417)，胰蛋白酶(北京索萊寶公司，T1320)，胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(北京索萊寶公司，LA0110)，鹽酸多巴胺(上海阿拉丁試劑公司，D103111)，杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo公司，10567014)，胎牛血清(美國(guó)Thermo公司，10091)，金黃色葡萄球菌(中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)化所，25923)，大腸桿菌(中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)化所，8739)，成骨細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)化所，MC3T3-E1)，細(xì)胞增殖檢測(cè)(CCK-8)試劑盒(上海碧云天生物公司，C0038)，青-鏈霉素(美國(guó)Sigma公司，V900929)，F(xiàn)ITC(美國(guó)Sigma公司，F(xiàn)ITC1)，DAPI(美國(guó)Sigma公司，10236276001)；X 射線光電子能譜分析儀(ESCALAB 250，美國(guó)Thermo公司)，多功能酶標(biāo)儀(Infinite M200，瑞士Tecan公司)，掃描電子顯微鏡(XL-30，荷蘭Philips公司)，恒溫水箱(DK-420S，上海精宏公司)，真空干燥箱(D2F-6050，上海精宏公司)，水接觸角測(cè)定儀(VCA 2000，美國(guó)AST公司)，真空冷凍干燥機(jī)(FD-1C-50，北京博醫(yī)康公司)，微量移液器(Finnpipette F1，美國(guó)Thermo公司)，超低溫冰箱(TLE50086A，美國(guó)Thermo公司)，超聲波清洗儀(YL-040S，深圳語(yǔ)路公司)。

1.2 熔融紡絲法制備PLLA纖維

將干燥的PLLA顆粒加入到溫度比PLLA聚合物的熔融溫度高10 ℃的預(yù)熱加熱管中，并加熱10～15 min。隨后，通過(guò)加熱管頂部注入氮?dú)狻．?dāng)熔體均勻流出時(shí)，在紡絲噴嘴的下端加入熱空氣(450 ℃，高于聚合物的熔融溫度)，PLLA的熔化物被高速熱空氣拉長(zhǎng)，熔化物到達(dá)金屬絲網(wǎng)收集器，此時(shí)即可得到PLLA纖維。

1.3 材料改性及分組

將PLLA纖維浸泡在聚多巴胺溶液(2 mg/mL)中，在低溫條件下避光反應(yīng)24 h，后用去離子水浸泡沖洗原材料3次，每次5 min，直至將表面未結(jié)合的聚多巴胺去除，此時(shí)材料僅有聚多巴胺接枝，記為PLLA/PDA纖維。將HHC-36溶解在無(wú)水乙醇中，制備濃度為1.5 mg/mL的溶液，用移液槍吸取抗菌肽溶液滴至洗凈的PLLA/PDA纖維表面，使其潤(rùn)濕材料，后置于真空干燥箱中在36.5 ℃下真空干燥20 min，此過(guò)程重復(fù)10次。最后用PBS溶液輕柔沖洗改性材料，將其表面未結(jié)合的抗菌肽洗去，置于冷凍干燥箱中干燥24 h，該組材料為聚多巴胺輔助接枝HHC-36材料組，記為PLLA/DH-36纖維。

1.4 性能表征

1.4.1 掃描電子顯微鏡檢測(cè) 使用掃描電子顯微鏡對(duì)PLLA纖維片、PLLA/PDA纖維片和PLLA/DH-36纖維片的表面形貌、尺寸進(jìn)行觀察，確定抗菌肽成功接枝到聚乳酸紡絲纖維上，使用NIH Image J軟件分析材料纖維的直徑大小分布。

1.4.2 XPS檢測(cè) 使用能量色散X射線能譜儀檢測(cè)PLLA纖維、PLLA/PDA纖維和PLLA/DH-36纖維中C、N、O元素的占比，檢測(cè)三種材料中元素是否有含量的變化。

1.4.3 接觸角測(cè)試 通過(guò)接觸角測(cè)定儀檢測(cè)接枝抗菌肽前后聚乳酸纖維水接觸角，分析其親水性。將PLLA纖維、PLLA/PDA纖維和PLLA/DH-36纖維壓成薄片，平鋪于潔凈的玻璃板表面，使用接觸角測(cè)量系統(tǒng)分別拍攝去離子水與各組材料即刻接觸的圖片及與材料接觸5 s后的圖片。

1.5 藥物體外緩釋試驗(yàn)

將抗菌肽溶于去離子水中，制備濃度梯度為2～100 mg/mL的19組溶液，在波長(zhǎng)450 nm下使用比色皿測(cè)試每個(gè)梯度濃度溶液的光密度值(OD值)，作出抗菌肽含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將PLLA/DH-36組材料置于PBS溶液中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中于1500 rpm下震動(dòng)培養(yǎng)30、90、150、270 min及24、72、120、168 h后測(cè)試其OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算抗菌肽的釋放量，同時(shí)計(jì)算抗菌肽的釋放速率。

1.6 抗菌性能測(cè)試

大腸桿菌(ATCC25539，中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所)和金黃色葡萄球菌(ATCC25923，中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所)用作試驗(yàn)菌，以評(píng)估抗菌棉的體外抗菌活性。

1.6.1 細(xì)菌和材料共培養(yǎng) 分別取上述細(xì)菌懸浮液(1×108cfu/mL)100 μL置于96孔板中，將20 mg材料置于孔板菌液中，每組設(shè)3個(gè)平行樣，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中混合培養(yǎng)。在培養(yǎng)30、60、90、150、270 min及18、24 h后分別測(cè)試其在600 nm波長(zhǎng)下的OD值，計(jì)算3個(gè)平行樣的平均OD值，表示菌液濃度。

1.6.2 抑菌環(huán)法 用LB液體培養(yǎng)基將S.aureus菌液稀釋100倍，E.coli菌液稀釋200倍后待用。在固體培養(yǎng)皿上涂布200 μL細(xì)菌懸浮液(1×108cfu/mL)，將三組材料置于培養(yǎng)皿上，37 ℃溫育14 h。通過(guò)觀察各組材料表面及周圍有無(wú)細(xì)菌區(qū)來(lái)定性測(cè)定抗菌棉對(duì)細(xì)菌的抑制作用。

1.6.3 細(xì)菌活/死染色法 分別將三組材料制成直徑為1 cm的樣品后置于24孔板中，制備1×108cfu/mL的S.aureus菌液，用LB液體培養(yǎng)基將其稀釋100倍后與樣品在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱混合培養(yǎng)6 h，之后除去懸液，將樣品用戊二醛溶液固定30 min，置于4 ℃冰箱中過(guò)夜保存。將固定好的樣品用PBS溶液輕柔沖洗3次，去除表面懸浮的細(xì)菌。每組設(shè)3個(gè)平行樣。用PBS溶液分別溶解活/死染色的兩種試劑，每種試劑取150 μL，將兩種試劑混合均勻后，取混合液加入含樣品的孔板種，每孔加入20 μL，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.7 細(xì)胞相容性測(cè)試

按照體積比在DMEM培養(yǎng)基中加入1%雙抗和10%胎牛血清制備H-DMEM培養(yǎng)基，用該培養(yǎng)基復(fù)蘇MC3T3-E1細(xì)胞后，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將各組樣品經(jīng)消毒處理后置于96孔板內(nèi)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞的密度將其接種至96孔板上，于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、3、7 d，后用PBS溶液洗滌各孔3次，加入含有10 μL CCK-8的培養(yǎng)液100 μL孵育2 h，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度值，并將各組進(jìn)行對(duì)照研究。每組樣品設(shè)置3個(gè)平行樣，且設(shè)置空白對(duì)照組。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用Origin 8.0進(jìn)行處理，使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 掃描電鏡分析

使用直徑為400 μm的噴絲頭，接收距離為41.5 cm時(shí)，纖維直徑較均勻且其表面光滑沒有未熔融聚合物。用掃描電鏡對(duì)各組纖維的形態(tài)和直徑進(jìn)行表征，圖像分析軟件Image J分析纖維直徑的尺寸分布范圍，約為8～16 μm。見圖1。

2.2 XPS分析

用XPS分別對(duì)PLLA組、PLLA/PDA組、PLLA/DH-36組樣品進(jìn)行表征，觀察材料表面的官能團(tuán)及N、O元素的含量變化。如圖2， PLLA組N含量為3.68%，PLLA/PDA組N含量為14.61%，PLLA/DH-36組N含量為17.08%。樣品中N元素含量的上升證明聚多巴胺輔助抗菌肽接枝成功。

2.3 親水性檢測(cè)

去離子水液滴和纖維表面之間測(cè)得的接觸角能反映材料表面潤(rùn)濕性。接觸角值越小，表明材料表面的潤(rùn)濕性越高，親水性也越強(qiáng)。如表1所示，在去離子水與樣品即刻接觸時(shí)，PLLA組纖維的水接觸角為123.63°，PLLA/PDA組纖維的接觸角為109.13°，而PLLA/DH-36組纖維的接觸角為0°；去離子水與樣品接觸5 s后，PLLA組纖維的接觸角為123.12°，而PLLA/PDA組纖維的接觸角迅速下降為0°，PLLA/DH-36組纖維的接觸角仍為0°。這表明了經(jīng)改性的纖維表面親水性增強(qiáng)，潤(rùn)濕性較好，有利于細(xì)胞黏附。

2.4 體外緩釋行為

根據(jù)抗菌肽的釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗菌肽HHC-36在PBS溶液中能穩(wěn)定釋放，其釋放量隨時(shí)間變化而持續(xù)增加；釋放速率初始時(shí)急速增大，在150 min時(shí)達(dá)至峰值，隨后逐漸下降，3 d后速率趨于平穩(wěn)。見圖3。研究表明，在150 min內(nèi)抗菌肽能完全發(fā)揮殺菌效果，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)及增殖。

表1 樣品的接觸角表征

2.5 體外抗菌性能

微生物感染會(huì)阻礙創(chuàng)口愈合過(guò)程，因此紡絲棉具有抗菌能力十分重要。使用傷口感染的常見菌E.coli和S.aureus評(píng)估紡絲棉的抗菌能力。如圖4及圖5所示，細(xì)菌與材料共培養(yǎng)的結(jié)果，PLLA/DH-36組的細(xì)菌濃度始終保持在一個(gè)較低的水平，表明該組材料抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長(zhǎng)的效果較PLLA組及PLLA/PDA組顯著；但是在抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)中，PLLA/DH-36組并沒有產(chǎn)生期望中的抑菌環(huán)，與其他兩組并無(wú)明顯差異，這可能與用于抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)的材料表面較干燥，抗菌肽很難從其纖維表面游離出來(lái)而發(fā)揮抑菌效果有關(guān)，這說(shuō)明PLLA/DH-36組材料的原位抗菌效果較好，不會(huì)產(chǎn)生全身毒性反應(yīng)。細(xì)菌的活/死染色實(shí)驗(yàn)證明，PLLA/DH-36組材料表面的死細(xì)菌數(shù)量較PLLA組多，活細(xì)菌數(shù)較少，這也證明其具有良好的抗菌性能。見圖6。

2.6 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)

對(duì)于填充材料來(lái)說(shuō)，良好的細(xì)胞相容性是其必備的性能，本研究通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)定量評(píng)估3種材料的細(xì)胞毒性。如圖7所示，培養(yǎng)1 d時(shí)，與空白對(duì)照組相比，3組材料的細(xì)胞增殖率均較低；在培養(yǎng)3 d時(shí)，與PLLA/PDA組相比，PLLA/DH-36組表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，但它與PLLA組的細(xì)胞毒性無(wú)明顯差異；在培養(yǎng)3 d后，3組材料的細(xì)胞毒性均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，恢復(fù)其良好的生物相容性，細(xì)胞增殖速率高于空白對(duì)照組。該結(jié)果表示經(jīng)PDA和HHC-36改性后的材料并沒有改變PLLA纖維良好的細(xì)胞相容性，細(xì)胞毒性未增加。通過(guò)熒光顯微鏡觀察經(jīng)DAPI-FITC染色的材料發(fā)現(xiàn)，PLLA/DH-36組材料表面的細(xì)胞存活率與PLLA組并無(wú)明顯差異，這與CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。見圖8。

3 討論

對(duì)于阻生尖牙的位置較深者，若直接行開窗助萌術(shù)則會(huì)造成較大創(chuàng)口。因此需利用外科中治療囊腫時(shí)使用的開窗減壓術(shù)，待其萌出到合適位置后再行助萌術(shù)，輔助阻生牙萌出到牙列正常位置[9]。但該愈合過(guò)程持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，需要定期沖洗創(chuàng)口、更換引流條來(lái)避免萌出道愈合和繼發(fā)感染，這會(huì)給患者的生活造成不便[10]。為減輕患者的痛苦，縮短治療時(shí)間，擬研究一種具有抗菌效果、可降解的填充材料應(yīng)用到開窗減壓術(shù)中。

抗菌肽是一種具有廣譜抗菌活性的氨基酸肽，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、真菌等的生長(zhǎng)都具有良好抑制效果，且其發(fā)揮作用的速度很快。研究[11]表明，含抗菌肽的涂層可以通過(guò)接觸殺死微生物細(xì)胞或通過(guò)局部釋放其活性成分來(lái)防止生物膜的形成，且它可與抗微生物化合物的協(xié)同作用以達(dá)到抗生物膜感染的效果。它可以通過(guò)多重機(jī)制發(fā)揮抗菌性能，是抗生素的有效替代物[7]。其中HHC-36更是性能最強(qiáng)的短鏈肽之一，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可大規(guī)模制備，臨床前景應(yīng)用廣泛。目前對(duì)用HHC-36修飾PLLA纖維表面的研究較少，對(duì)于其效果及相應(yīng)的細(xì)胞毒性并不十分明確。貽貝啟發(fā)性的多巴胺(DA)是人體內(nèi)眾所周知的一種神經(jīng)遞質(zhì)，它可與多種物質(zhì)結(jié)合，能在弱堿性溶液環(huán)境中，在氧氣的參與下發(fā)生自聚合反應(yīng)形成聚多巴胺(PDA)薄膜[12]。更重要的是，PDA薄膜可作為二級(jí)反應(yīng)平臺(tái)介導(dǎo)可控的多種大分子活性聚合反應(yīng)，為PDA在表面改性方面的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)[13]。以往有研究[14-15]證明，PDA可在多種材料表面形成涂層。目前 PDA自聚合機(jī)理尚未研究清楚，但是接枝藥物是明確的。PDA分子中存在的兒茶酚基團(tuán)，多巴醌結(jié)構(gòu)和氨基基團(tuán)，能夠和活性藥物的氨基，羧基等基團(tuán)發(fā)生化學(xué)共價(jià)結(jié)合反應(yīng)，從而將藥物固定在材料表面[16-17]。同時(shí)因?yàn)镻LLA纖維是具有三維立體結(jié)構(gòu)的材料，其立體結(jié)構(gòu)有助于聚多巴胺輔助抗菌肽在其表面的吸附。

本研究通過(guò)聚多巴胺將HHC-36接枝于PLLA纖維表面，通過(guò)其表面形貌等理化性能表征、抗菌性能、細(xì)胞相容性、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等來(lái)評(píng)估改性纖維的性能。為PLLA仿生棉在醫(yī)學(xué)填充材料領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)電鏡掃描后發(fā)現(xiàn)纖維直徑較均勻且其表面光滑沒有未熔融聚合物，說(shuō)明聚乳酸紡絲纖維改性成功；其次，XPS檢測(cè)顯示PLLA組N含量為3.68%，PLLA/PDA組N含量為14.61%，PLLA/DH-36組N含量為17.08%，該結(jié)果表明樣品中N元素含量的上升，亦證明聚多巴胺輔助抗菌肽接枝成功；另外，親水性檢測(cè)顯示，在去離子水與樣品即刻接觸時(shí)，PLLA組纖維的水接觸角為123.63°，PLLA/PDA組纖維的接觸角為109.13°，而PLLA/DH-36組纖維的接觸角為0°，去離子水與樣品接觸5 s后，PLLA組纖維的接觸角為123.12°，而PLLA/PDA組纖維的接觸角迅速下降為0°，PLLA/DH-36組纖維的接觸角仍為0°，而去離子水液滴和纖維表面之間測(cè)得的接觸角能反映材料表面潤(rùn)濕性，且接觸角值越小，表明材料表面的潤(rùn)濕性越高，親水性也越強(qiáng)，說(shuō)明經(jīng)改性的纖維表面親水性增強(qiáng)，潤(rùn)濕性較好，有利于細(xì)胞黏附，這與之前研究[18]一致。

抗菌性能中，PLLA/DH-36組材料不能如其他研究產(chǎn)生較明確的的抑菌環(huán)，可能由于用于抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)的材料表面較干燥，抗菌肽不不能順利從其表面游離出來(lái)所致，表明改性材料的原位抑菌效果較好，只會(huì)在植入局部發(fā)生抗菌反應(yīng)，不會(huì)引起宿主較嚴(yán)重的全身反應(yīng)。PLLA/DH-36對(duì)金葡菌和大腸桿菌的抑制效果均較好，在材料與菌液共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)18 h時(shí)的細(xì)菌濃度較之前有小幅度上升，可能由于前后觀察的時(shí)間間隔較久，細(xì)菌濃度有所提高，24 h時(shí)的細(xì)菌濃度較18 h繼續(xù)下降也證明了改性材料在24 h時(shí)仍有抗菌效果。細(xì)菌活/死染色實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不易觀察的原因可能是PLLA/DH-36材料具有三維立體結(jié)構(gòu)，細(xì)菌在該結(jié)構(gòu)里附著，纖維交織處染色成團(tuán)加深，不易看到單個(gè)較明顯的細(xì)菌形態(tài)。這在掃描電鏡觀測(cè)材料表面細(xì)菌及細(xì)胞形態(tài)中也有發(fā)生，導(dǎo)致該部分觀察結(jié)果缺如。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可將材料壓制成實(shí)片、在其表面接種細(xì)菌和細(xì)胞后再進(jìn)行觀測(cè)。細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)表明，改性后的PLLA/DH-36組材料的細(xì)胞毒性較原始PLLA組材料并未增加，依舊保留PLLA纖維良好的生物相容性，而3 d內(nèi)所觀測(cè)到的細(xì)胞毒性可能由于AMPs的突然釋放有關(guān)，說(shuō)明PLLA/DH-36組材料具有良好的生物安全性，對(duì)于臨床來(lái)說(shuō)具有重要意義。

綜上，作為一種高分子材料，經(jīng)改性后的PLLA/DH-36具有良好的機(jī)械性能、抗菌活性、生物相容性等特點(diǎn)，對(duì)E.coli和S.aureus生長(zhǎng)的抑制效果很好，可通過(guò)多種機(jī)制殺菌，而S.aureus是口腔環(huán)境的常居菌，可通過(guò)生物膜感染導(dǎo)致許多種慢性疾病，改性材料能對(duì)其發(fā)揮抑制作用，有利于它作為填充材料用于阻生齒導(dǎo)致的囊腫開窗減壓術(shù)后。這種改性的PLLA/DH-36材料具有的良好性能為抗菌肽修飾纖維表面的基礎(chǔ)研究奠定了基礎(chǔ)，也為改性材料作為填充材料應(yīng)用于口腔臨床提供了科學(xué)依據(jù)。