產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的鑒定與酶活力比較

江學(xué)斌，成雪鴻，馬苗鵬，鄧仲晴，李嘉慧

（1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

【研究意義】纖維素廣泛存在于各種生物質(zhì)中，是地球上最豐富的多糖物質(zhì)和天然可再生有機(jī)物質(zhì)。我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的纖維素主要為麥麩、秸稈等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，每年可生產(chǎn)約10.4億t［1］。纖維素酶是一種能夠通過(guò)生物催化作用降解纖維素并生成葡萄糖的酶，但它并不是一種由單一酶系構(gòu)成的單體酶，而是一種具有協(xié)同作用、具有多個(gè)組分酶系組成的復(fù)合酶，其主要組分有外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等，還含有很高活力的木聚糖酶［2］。目前，纖維素酶在食品加工［3-5］、紡織［6］、造紙［7-8］、生物煉制［9-10］和生物燃料［11-12］等行業(yè)均有應(yīng)用。纖維素酶最早應(yīng)用于動(dòng)物飼料工業(yè)［13］，纖維素是草食家畜飼料的主要來(lái)源，但是除反芻動(dòng)物借助瘤胃微生物可利用部分纖維素外，其他動(dòng)物（如豬、雞等單胃動(dòng)物）不能利用纖維素［14］。研究發(fā)現(xiàn)，使用纖維素酶和發(fā)酵菌劑等飼料添加劑能夠降低秸稈飼料中纖維素和半纖維素的含量，增加可溶性碳水化合物、粗蛋白的含量，提高秸稈飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，增強(qiáng)畜禽免疫力［15-17］。因此，鑒定和篩選纖維素酶高產(chǎn)菌株，對(duì)畜禽的健康養(yǎng)殖、環(huán)境保護(hù)、資源再生與可循環(huán)利用等均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】纖維素酶來(lái)源廣泛，目前篩選纖維素酶高產(chǎn)菌株通常從一些富含腐殖質(zhì)的土壤、反芻動(dòng)物的瘤胃及其糞便等獲得菌株，也有從植物內(nèi)生菌中分離具有纖維素酶的菌株，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩后，對(duì)纖維素降解能力較高的菌株進(jìn)行酶活力測(cè)定［18-19］。許云等［20］對(duì)從不同大薯根部土壤中分離出1株高產(chǎn)纖維素酶蠟狀芽孢桿菌菌株，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下纖維素酶活力為137.10 U/mL；葛永怡等［21］從畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中分離到3株產(chǎn)纖維素酶的真菌菌株，通過(guò)復(fù)篩，獲得1株酶活性較高的青霉屬菌株；王大為等［22］從富含腐殖質(zhì)的土壤樣品中分離到一批纖維素分解菌株，復(fù)篩得到1株纖維素降解能力較強(qiáng)的菌株，羧甲基纖維素酶活達(dá)65.89 U/mL。另有研究報(bào)道從重樓根莖［23］、香樟葉片［24］中分離出可降解纖維素的內(nèi)源真菌?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根據(jù)現(xiàn)有研究可知，真菌、細(xì)菌和放線菌均具有產(chǎn)生纖維素酶的能力，且因微生物來(lái)源的酶易獲取且可大規(guī)模生產(chǎn)，鑒定和篩選纖維素酶高產(chǎn)菌株逐漸成為研究熱點(diǎn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)前期實(shí)驗(yàn)室分離得到的14株細(xì)菌，通過(guò)剛果紅平板染色和酶活測(cè)定法篩選產(chǎn)纖維素酶菌株，采用形態(tài)特征觀察及16S rDNA序列對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，以期為新型飼料添加劑提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)菌株：14 株未鑒定菌株，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑：質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%剛果紅溶液、1 mol/L氯化鈉溶液、0.1 mol/L pH 5.5 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、1.0 mg/mL 葡萄糖溶液、8 mg/mL 羧甲基纖維素鈉溶液、DNS 試劑。細(xì)菌通用引物27F（5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'TACGGCTACCTTGTACGACTT-3'）購(gòu)自廣州生工生物科技有限公司，PCR mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

培養(yǎng)基：YPD 固體培養(yǎng)基（1 g 酵母粉、2 g蛋白胨、2 g 蔗糖、1.6 g 瓊脂，溶于100 mL 水，pH 6.8～7.0），纖維素酶活篩選培養(yǎng)基（在YPD固體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入0.1%羧甲基纖維素鈉），液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基（1 g酵母粉、2 g蛋白胨、2 g 羧甲基纖維素鈉，溶于100 mL 水，pH 6.8～7.0），羧甲基纖維素鈉瓊脂培養(yǎng)基（2 g 羧甲基纖維素鈉、2 g 瓊脂粉，溶于100 mL 水）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選與鑒定 （1）菌種活化：將超低溫冰箱保存的14 株未鑒定菌種接種于YPD 固體培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，在平板上純化2 次，觀察并記錄菌落形態(tài)。

（2）產(chǎn)纖維素酶菌株初篩：采用點(diǎn)接法從YPD 平板上挑取單菌落接種于纖維素酶活篩選平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，用1%剛果紅溶液浸沒(méi)平板，并在室溫下孵育30 min，然后用適量1 mol/L 氯化鈉溶液脫色2 次，每次約20 min，觀察菌落周圍是否有透明圈，初步篩選產(chǎn)纖維素酶菌株。

（3）菌種鑒定：對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行16S rDNA 序列PCR 擴(kuò)增。引物為通用引物27F、1492R。PCR 反應(yīng)體系（40 μL）：模板DNA（菌液）5 μL、2×Champagne Taq Buffer（Mg2+plus）20 μL、27F（10 μmol/L）1.6 μL、1492R（10 μmol/L）1.6 μL、dNTP Mixture（10 mmol/L）0.8 μL、Champagne Taq DNA polymerase（2.5 U/mL）0.8 μL，補(bǔ) 足 ddH2O至40 μL。PCR 反應(yīng)條件：98℃變性5 min；95℃變 性15 s、57.5 ℃退火15 s、72 ℃延伸100 s，33 次循環(huán)；72℃延伸5 min，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分，目標(biāo)片段約1 600 bp。PCR 產(chǎn)物由北京擎科生物科技公司進(jìn)行測(cè)序，將獲得的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源性分析。

1.2.2 粗酶液制備 將產(chǎn)纖維素酶菌株接種于10 mL 液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)1 d，菌液經(jīng)0.22 μm微濾膜過(guò)濾，所得濾液即為粗酶液。

1.2.3 菌株降解纖維素能力比較 （1）剛果紅染色法初步比較粗酶液的纖維素酶活性：用打孔器對(duì)羧甲基纖維素鈉瓊脂平板進(jìn)行打孔，孔直徑為2 mm，每孔注入10 μL 粗酶液，37℃培養(yǎng)1 d，經(jīng)剛果紅染色和脫色后，觀察對(duì)比平板各透明圈大小，可作為各菌種纖維素酶活性的依據(jù)之一。

（2）纖維素酶活力定量檢測(cè)：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別在各比色管中加入1.0 mg/mL 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mL，各管分別添補(bǔ)0.1 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）至1 mL，再加入1.5 mL DNS 試劑，充分搖勻后沸水浴5 min，冰水浴迅速冷卻后定容至5.0 mL。以不加葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液為空白，540 nm 下測(cè)定吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

纖維素酶活力檢測(cè)：待測(cè)粗酶液1 倍稀釋后使用，以8 mg/mL 羧甲基纖維素鈉溶液作為底物，與待測(cè)粗酶液于恒溫水浴鍋中50℃預(yù)熱5 min。取3 支比色管，在第1、第2 根比色管中各加入8 mg/mL 纖維素鈉溶液0.5 mL、待測(cè)酶液0.5 mL，在50 ℃水浴鍋中計(jì)時(shí)準(zhǔn)確反應(yīng)15 min，加入1.5 mL DNS 試劑，并在第3 根比色管中加入待測(cè)酶液0.5 mL，充分搖勻，沸水浴5 min，迅速冷卻定容至5.0 mL。以第3 支比色管中試液作為對(duì)照，測(cè)定540 nm 波長(zhǎng)下第1、第2 根比色管試液的吸光度。以上試驗(yàn)3 次重復(fù)，取平均值。

酶活力計(jì)算：50℃、pH 5.5 條件下，每分鐘從8 mg/mL羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放出1 μmol還原糖所需要的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U），還原糖以葡萄糖等量值計(jì)算：

式中，M 為產(chǎn)生葡萄糖量（mg）；180 為葡萄糖分子量（mg/μmol）；15 為待測(cè)粗酶液與底物反應(yīng)時(shí)間（min）；0.5 為加入反應(yīng)的待測(cè)粗酶液的量（mL）；2 為粗酶液樣品的稀釋倍數(shù)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Excel 軟件進(jìn)行初步處理后，用GraphPad Prism 9 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選與鑒定

14 株細(xì)菌用纖維素酶活篩選平板培養(yǎng)1 d，經(jīng)剛果紅染色和脫色后，有7 株細(xì)菌的菌落周圍形成透明圈，可知這7 株細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶，分別編號(hào)為L(zhǎng)W001～LW007。挑取菌落在YPD 平板上劃線純化，37℃培養(yǎng)20 h 后，LW001 呈白色微黃，梭子橢圓形，干燥無(wú)褶皺；LW002 呈白色偏黃，梭子橢圓形，干燥無(wú)褶皺；LW003 呈白色偏黃，不規(guī)則圓形，邊緣波浪狀，表面干燥光滑；LW004 呈白色，多為圓形，少數(shù)不規(guī)則，表面干燥光滑；LW005 呈白色偏黃，多為圓形，少數(shù)不規(guī)則，表面干燥光滑；LW006 偏黃，略透明，微微隆起，邊緣有褶皺，濕潤(rùn)黏稠；LW007 偏黃，呈不規(guī)則圓形，有褶皺（圖1）。

圖1 菌落形態(tài)Fig.1 Colony of morphologies

對(duì)7 株產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行16S rDNA 序列PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，采用Contig Express 軟件將序列結(jié)果進(jìn)行拼接，拼接后的完整序列經(jīng)BLAST 比對(duì)（表1），結(jié)果（表2）顯示7 株細(xì)菌均為芽孢桿菌屬，其中LW001、LW002、LW003、LW007 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），LW004、LW005、LW006 為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表1 7 株產(chǎn)纖維素酶菌株16S rDNA 序列同源性比較Table 1 Comparison of 16S rDNA sequence homology of 7 celllulase-producing strains

表2 7 株產(chǎn)纖維素酶菌株鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of 7 celllulase-producing strains

2.2 菌株降解纖維素能力比較

采用剛果紅染色法初步比較粗酶液的纖維素酶活性，結(jié)果（圖2）顯示，在打孔區(qū)域周圍形成透明圈，根據(jù)透明圈大小，初步判定7 株芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶能力大小為L(zhǎng)W006＞LW005＞LW 004＞LW002＞LW007＞LW003＞LW001。其 中，菌株LW001 降解纖維素能力最弱，透明圈直徑為8 mm；菌株LW006 降解纖維素能力最強(qiáng)，透明圈直徑為22.5 mm。雖然各粗酶液產(chǎn)生的透明圈可直觀，其大小可作為初步判斷各粗酶液纖維素酶活性高低的依據(jù)之一，但不能作為菌株纖維素酶活性的唯一定量指標(biāo)，因此需進(jìn)一步測(cè)定這些菌株的產(chǎn)酶能力。

圖2 7 株產(chǎn)纖維素酶菌株形成的透明圈大小比較Fig.2 Comparison of transparent circles formed by 7 celllulase-producing strains

以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)、A540為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0026x-0.0568，相關(guān)系數(shù)R2=0.9909。

圖3 葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Glucose standard curve

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及酶活力計(jì)算公式，計(jì)算出7株芽孢桿菌粗酶液中纖維素酶的活力大小，結(jié)果（圖4）顯示，LW006＞LW005＞LW0 04＞LW007＞LW003＞LW002＞LW001。其中，菌株LW001纖維素酶活力最低，為0.19（±0.00）U/mL；菌株LW006纖維素酶活力最高、為1.22（±0.07）U/mL，與菌株LW001差異極顯著，與剛果紅染色法透明圈試驗(yàn)所得結(jié)果相同。

由圖4 可知，枯草芽孢桿菌LW004、LW005、LW006 降解纖維素能力比地衣芽孢桿菌LW001、LW002、LW003、LW007 強(qiáng)。不同菌種產(chǎn)纖維素酶能力不同，同一菌種的不同菌株降解纖維素能力也存在差異。地衣芽孢桿菌中，以LW001 降解纖維素能力最弱；枯草芽孢桿菌中，以LW006 降解纖維素能力最強(qiáng)。

圖4 7 株產(chǎn)纖維素酶菌株的纖維素酶活力測(cè)定結(jié)果Fig.4 Cellulase activity assay results of 7 cellulase-producing strains

3 討論

自然界中廣泛存在產(chǎn)纖維素酶的微生物，其中土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬芽孢桿菌屬種類豐富。李菲等［25］從廣西紅樹林土壤中篩選出9 株具有顯著纖維素酶活性的芽孢桿菌，其中4 株菌株在40～60℃條件下生長(zhǎng)良好，在60℃時(shí)纖維素分解能力達(dá)到最高，具有顯著的熱穩(wěn)定性。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的14 株菌株進(jìn)行纖維素酶活性篩選，初步選出7 株具有一定纖維素酶活性的菌株，經(jīng)16S rDNA 測(cè)序鑒定，其中3 株為枯草芽孢桿菌、4 株為地衣芽孢桿菌，是土壤中常見的芽孢桿菌。芽孢桿菌所產(chǎn)酶的種類也較多［14］，除纖維素酶、木聚糖酶等木質(zhì)纖維降解酶外，還可分泌蛋白酶和淀粉酶。不同菌種的生長(zhǎng)條件、產(chǎn)酶條件及其酶的活力均存在差異。在酶活力單位定義相同時(shí)，吳靜［26］篩選出一株降解纖維素的青霉菌，在最佳培養(yǎng)條件下酶活達(dá)3.79（±0.11）U/mL；趙龍妹等［27］獲得產(chǎn)纖維素酶菌株巨大芽孢桿菌，該菌30℃生長(zhǎng)20 h 時(shí)所產(chǎn)纖維素酶活力最高、達(dá)0.774 U/mL；鄭麗等［28］從298 個(gè)菌株中篩選出57 個(gè)可產(chǎn)纖維素酶菌株，其中水解圈最大直徑達(dá)15 mm，菌株HWY-3-9（解淀粉芽孢桿菌）酶活力最高、為0.0012 U/mL；何深宏等［29］從57 株菌株中篩選出10 株有較高纖維素酶活性，其中菌株X10（解淀粉芽孢桿菌）的纖維素酶活最高、為0.177 U/mL。本研究篩選出的7 株產(chǎn)纖維素酶菌株，在37℃下培養(yǎng)1 d 后產(chǎn)酶能力不同，其中菌株LW006（枯草芽孢桿菌）降解纖維素能力最強(qiáng)，其透明圈直徑為22.5 mm，產(chǎn)纖維素酶的酶活力最高、為1.22（±0.07）U/mL，與上述學(xué)者分離所得的產(chǎn)纖維素酶菌株相比處于較高水平，后續(xù)對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化、蛋白質(zhì)工程和基因工程等改造［30-31］，菌株將可能獲得更高的纖維素酶活力，具有較高的開發(fā)潛力。

4 結(jié)論

本研究從實(shí)驗(yàn)室的14 株菌種初步篩選出7株產(chǎn)纖維素酶菌株，經(jīng)16S rDNA 同源性分析鑒定，其中4 株為地衣芽孢桿菌、3 株為枯草芽孢桿菌。通過(guò)剛果紅染色得到1 株纖維素降解能力較強(qiáng)的菌株LW006（枯草芽孢桿菌），經(jīng)DNS 法測(cè)定，其纖維素酶活力可達(dá)1.22（±0.07）U/mL（P＜0.01）。無(wú)抗養(yǎng)殖是大勢(shì)所趨，本研究篩選的7 株產(chǎn)纖維素酶菌株為微生物添加劑提供新的菌種資源，在家禽的健康養(yǎng)殖中具有重要意義。