樟樹葉純露揮發性成分與抑菌活性研究

楊素華，曾憲彪，鄧聿胤，陸順忠，黎貴卿，蘇驪華，黨中廣

（1.廣西壯族自治區林業科學研究院/廣西特色經濟林培育與利用重點實驗室，廣西 南寧 530002；2.廣西壯族自治區中醫藥研究院，廣西 南寧 530022）

【研究意義】精油一般是指采用水蒸氣蒸餾從天然植物的枝、葉、根、干、果等部位提取出來的芳香揮發油，具有抗菌活性，可以抑制細菌或者真菌的生長，已被廣泛應用于食品加工、醫療保健、化妝品及農藥研發等方面［1-3］。純露是指水蒸氣蒸餾提取芳香植物精油過程中，水蒸氣冷凝下來的的副產品，含有少量的精油成分及活性物質，具有良好的抗菌、驅蟲、保健作用［4］。探討芳樟醇型、檸檬醛型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露的揮發性成分、物理性質和抑菌效果，為樟樹葉純露作為天然防腐劑和消毒產品等提供參考。【前人研究進展】前人研究發現蒲公英、生姜、薄荷、艾葉、內蒙古薰衣草、香葉天竺葵等植物純露具有抑菌性和抗氧化性［5-13］。王斌等［14］研究發現迷迭香純露、薄荷純露和玫瑰純露對鮮切芋頭具有很好的保鮮作用。張洪廣等［15］研究發現玫瑰純露具有保濕、美白、抗氧化等功效，可以開發成化妝水、消毒劑、果蔬保鮮劑等。樟樹是主要的天然芳香植物樹種，按樟樹葉精油的主要成分，可將樟樹葉精油分為芳樟型、油樟型、龍腦型、檸檬醛型等不同化學類型［16-21］。目前對樟樹的研究，主要集中在精油的抗氧化性和抑菌性。李嘉欣等［22］研究發現異樟、腦樟、油樟和芳樟葉精油均具有一定的抗氧化能力。張平等［23］采用二倍釋法測定油樟油對沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果時，發現油樟油中具有抑菌活性的主要物質為松油烯-4-醇和1，8-桉葉油素。王芳等［24］采用二氧化碳膨脹乙醇從香樟葉中提取精油，發現精油對真菌有較高的抑制活性。對樟樹葉純露的研究甚少。吳芳等［25］以不同季節宜賓油樟葉純露為研究對象，通過抑菌圈、最低抑菌濃度和最低殺菌濃度，研究不同季節純露對大腸埃希氏菌、福氏志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌的抑菌活性，發現油樟葉純露中的主要組分為1，8-桉葉油素、α-松油醇和松油烯-4-醇，不同季節純露對4 種供試微生物均有明顯的抑菌效果，對金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。可見純露作為精油生產副產物，具有一定的開發潛力。【本研究切入點】目前對樟樹的研究主要集中在精油的抗氧化性和抑菌性，對樟樹葉純露的研究甚少。本研究通過采用水蒸氣蒸餾法提取芳樟醇型、檸檬醛型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露，探討純露的揮發性成分、物理性質和抑菌效果。【擬解決的關鍵問題】本研究以檸檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露為試驗材料，研究其主要成分、物理性質及其對幾種常見食源性致病微生物的抗菌效果，以期為純露的開發利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要儀器：恒溫細菌培養箱（HYQX-II）、恒溫霉菌培養箱（MJ-300），上海躍進醫療器械有限公司；高壓滅菌鍋（SX-500），TOMY公司；高溫干燥烤箱（BPG-9050AH），上海一恒科學儀器有限公司；恒溫（30~38℃）水浴鍋（HH-6），常州國華儀器有限公司；電熱套（98-I-B），天津市泰斯特儀器有限公司；氣相色譜儀（Agilent 7890A）、氣相色譜-質譜聯用儀（Agilent 7890B-5977A），安捷倫科技有限公司；0.2 μm薄膜篩濾過除菌器（MILLEX GP）、旋轉蒸發儀（RE－52AA），上海亞榮生化儀器廠。

不同化學類型的新鮮樟樹葉采自廣西壯族自治區林業科學研究院海拔為85 ～255 m 的種質資源庫，每種化學型選取3 株，于2021 年5 月在同一株樟樹的東、南、西、北、中等不同部位采集鮮葉約1 500 g。樣品用塑料袋密封，置于4℃冰箱低溫保存，待測。

培養基：胰酪大豆蛋白胨液體培養基（批號201010）、胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養基（批號190815）、沙氏液體培養基（批號190326）、沙氏瓊脂培養基（批號200927），購自北京陸橋技術有限公司。

對照品：陽性對照品包括抗細菌的復方新諾明（400 mg 磺胺甲惡唑、80 mg 甲氧芐胺嘧啶，上海新亞藥業閔行有限公司），抗真菌的洗必泰（廣州邦樂達生物科技有限公司）；陰性對照品為生理鹽水（0.9%，上海方太醫療器械有限公司）；固體溶劑對照品：二甲亞砜、標準緩沖液（廣東光華科技股份有限公司）。

供試菌株：金黃色葡萄球菌（Staphyloccus aureus）〔CMCC（B）26003〕，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63501〕，大腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44102〕，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10104〕，白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（B）98001〕，以上標準菌株均由廣東環凱科技有限公司提供，供試菌株由凍干質控菌種轉種所生，是本種源的5 代內后裔。

1.2 試驗方法

1.2.1 純露的提取 將采集到的新鮮葉子剪至1~2 cm，稱取1 000 g 葉子和去離子水1 000 mL置于揮發油裝置中，加沸石進行水蒸氣蒸餾3.5 h，收集揮發油測定器中的下層液體即得飽和純露。再取500 mL 飽和純露和50 mL 石油醚混合搖勻，將混合液用分液漏斗分離，分離后將上層油狀有機液放入250 mL 錐形瓶，下層水溶液置于分液漏斗，再加入50 mL 石油醚后再分離，反復操作2 次。將3 次收集的油狀有機液體加入25 g 硫酸鈉，脫水，取上層油狀液體于200 mL 雞心瓶，在真空為-0.06 MPa，溫度為46~48℃、轉速為60 r/min的旋轉蒸發儀上旋蒸1 min，即得到純露揮發油。

1.2.2 純露的主要成分分析 升溫程序：色譜柱HP-INNOWAX（30 m×0.32 mm，0.5 μm）。初始溫度70℃，以1.5 ℃/min 升至100℃，然后以3℃/min升至135℃，保持30 min，然后再以5℃/min 升至200℃，最后以10℃/min 升至250℃，保持10 min。進樣量0.2 μL，進樣口溫度250℃，分流比50∶1，流速1 mL/min。

質譜條件：電離方式E1，電離能量70 eV，離子源溫度250℃，質量掃描范圍30~450 amu。

1.2.3 純露的物理性質測定 pH 值：將pH 計的電極、蒸餾水和標準緩沖液調至25℃，用蒸餾水沖洗電極，用標準緩沖液校正pH 計。稱取純露100 mL 加入燒杯，將pH 計電極插入試樣，待讀數穩定后記錄讀數。平均測定3 次。

相對密度：采用密度瓶法測定。

耐熱：在40℃下保持24 h，恢復至室溫，觀察有無分層現象。

耐寒：在-8℃下保持24 h，恢復至室溫，觀察有無分層現象。

離心考驗：在轉速2 000 r/min 下旋轉30 min，觀察有無分層現象。

1.2.4 純露的抑菌活性檢測 培養基制備：取胰酪大豆蛋白胨液體培養基30 g、胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養基40 g、沙氏液體培養基50 g、沙氏瓊脂培養基70 g，分別用蒸餾水配成1 L 溶液，高壓滅菌，密封存放，備用。

菌懸液制備：取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠膿假單孢菌、枯草芽孢桿菌凍干質控菌種的新鮮培養物接種至胰酪大豆蛋白胨液體培養基，置于35℃培養24 h，轉入無菌生理鹽水，稀釋，倒入胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養基，置于35℃培養24 h；取白色念珠菌凍干質控菌種的新鮮培養物接種至沙氏液體培養基，置于25℃培養48 h，轉入無菌生理鹽水，稀釋，倒入沙氏瓊脂培養基，置于25℃培養48 h；試驗菌懸液細菌密度約為50~100 CFU/mL。

抑菌性試驗：分別采用試管二倍稀釋法和紙片法。

試管法：抗金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌試驗：試驗在超凈工作臺上進行，取待檢純露、陽性（復方新諾明）試驗藥液、陰性試驗藥液滅菌玻璃試管各5 支，每管加胰酪大豆蛋白胨液體培養基2 mL，待檢純露、陽性（復方新諾明）試驗藥液、陰性試驗藥液2 mL加至第l 管，混勻后取2 mL 加至第2 管，同法依次對倍稀釋至第5 管，各管藥液稀釋度分別為2、4、8、16、32 倍。第5 管混勻后棄去2 mL。然后每管加入細菌密度約為50 ～100 CFU/mL 的試驗菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌）懸液0.1 mL。另取2 支試管做陽性、陰性對照。置35℃培養24 h。該培養管的待檢藥物濃度即為待檢藥物的最低抑菌濃度 （MIC）。取無菌生長或菌生長受抑制試管內的培養物0.1 mL注入平皿，加注不超過45℃的胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養基15~20 mL，待冷后倒置于35℃培養箱，倒置培養24 h，觀察有無菌落生長，取瓊脂培養基生長菌落不超過5 個者，與其相對應的培養管藥物濃度，即為該待檢藥物的最低殺菌濃度（MBC）［28］。重復5 次。

抗白色念珠菌試驗：再取待檢純露、陽性（復方新諾明）試驗藥液、陰性試驗藥液滅菌玻璃試管滅菌玻璃試管各5 支，每管沙氏液體培養基2 mL。取已配制和除菌處理過的待檢純露、陽性（洗必泰）試驗藥液、陰性試驗藥液）2 mL 加至第1 管，混勻后取2 mL 加至第2 管，同法依次對倍稀釋至第5 管。第5 管混勻后棄去2 mL。然后每管加入細菌密度約為50~100 CFU/mL 的試驗菌（白色念珠菌）懸液0.1 mL。另取2 支試管做陽性、陰性對照。置25℃培養48 h。每藥作雙樣品測定，培養后觀察有無菌生長，記錄MIC 和MBC。每種藥對同一個細菌，同樣過程重復5 次。

紙片法：取厚濾紙，用直徑6 mm 沖子打出圓形紙片若干，高壓滅菌。每一紙片吸取揮發油、純露、復方新諾明、洗必泰、生理鹽水、二甲亞砜浸濕，備用。分別將藥帖片貼片帖貼于涂有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌，綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆蛋白胨瓊脂培養基平皿內培養24 h；分別將藥帖片貼片帖貼于涂有白色念珠菌的沙氏瓊脂培養基平皿內培養48 h。培養后測量帖片周圍抑菌圈直徑。每個處理3 次重復。抑菌圈實驗結果判定參照以下標準：抑菌圈直徑>20 mm 為極度敏感，15~20 mm 為高度敏感，10~15 mm 時為中度敏感，7~9 mm 時為低度敏感，<7 mm為不敏感［26］。

2 結果與分析

2.1 不同化學類型樟樹葉純露的成分及其相對質量

將所測成分的色譜峰與NIST14質譜數據庫進行比對檢索，并按相對豐度、質荷比、匹配度等進行核對比較，對各色譜峰所對應的物質加以確認，并采用色譜峰面積歸一化法，得出不同化學類型樟樹葉純露平均相對質量分數>1%的主成分。由表1可見，芳樟醇型純露平均相對質量>1%的化合物有6種，分別為γ-松油烯、芳樟醇、樟腦、4-松油醇、α-松油醇、香芹酚，純露的主要成分為芳樟醇，平均相對質量為74.03%；檸檬醛型純露平均相對質量>1%的化合物有10種，分別為芳樟醇、龍腦、4-松油醇、α-松油醇、香茅醇、橙花醛、香葉醇、香葉醛、葎草烯、石竹烯氧化物，純露的主要成分為橙花醛和香葉醛，平均相對質量分別為14.23%、29.26%；油樟型純露平均相對質量>1%的化合物有6種，分別為檸檬烯、1，8-桉葉油素、芳樟醇、龍腦、4-松油醇、α-松油醇，純露的主要成分為1，8-桉葉油素，平均相對質量為50.36%；龍腦型純露平均相對質量>1%的化合物有5種，分別為檸檬烯、樟腦、龍腦、香芹酚、石竹烯，純露的主要成分為龍腦，平均相對質量為82.27%。檸檬醛型純露平均相對質量>1%的化合物數量最多。

表1 不同化學類型樟樹葉純露的成分及其相對質量Table 1 Components and relative mass of hydrosols from different types of Cinnamomum camphora leaves

2.2 不同化學類型樟樹葉純露的物理性質

由表2 可見，檸檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露均為無色澄清液體，均具有各自的特征氣味，pH 值均為弱酸性，相對密度均>1.0000。不同化學類型純露的pH 值和相對密度相差不大，其中龍腦型純露的pH 值和相對密度稍高于其他類型純露。從耐熱、耐寒、離心考驗等指標來看，不同化學類型純露的性質比較穩定，不會在溫度反復變化或者轉動的情況下發生改變或者加速老化。

表2 不同化學類型樟樹葉純露的物理性質 Table 2 Physical properties of hydrosol from different types of Cinnamomum camphora leaves

2.3 不同化學類型樟樹葉純露的抑菌活性

檸檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露的抑菌圈直徑見表3。參照抑菌圈實驗結果判定標準進行評價后發現，在合適溫度下，各菌株經合適時間培養，菌落或菌苔生長良好，菌落特征符合菌株菌落特征。陽性藥帖片周圍有明顯抑菌圈，陰性藥帖片周圍無抑菌圈。不同化學類型純露對以白色念珠菌為代表的真菌均有抑制作用，油樟型純露還對枯草芽孢桿菌有抑制作用，其他化學類型對細菌沒有抑制作用。其中檸檬醛型、芳樟醇型純露對白色念珠菌的抑菌圈直徑均>20 mm，屬于極度敏感，抑菌圈直徑均為25 mm，抗菌效果很好。油樟型純露對枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑菌圈直徑都為6 mm，屬于不敏感。龍腦型純露對白色念珠菌的抑菌圈直徑為10 mm，屬于中度敏感。

表3 不同化學類型樟樹葉純露的抑菌圈直徑Table 3 Diameter of inhibition zone of hydrosols from different types of Cinnamomum camphora leaves (mm)

檸檬醛型、芳樟醇型、油樟型、龍腦型樟樹葉純露的MIC 和MBC 見表4。在合適溫度下，各菌株經合適時間培養，有菌無藥對照管混濁有菌生長，有藥無菌對照管澄明無菌生長，陽性藥管呈澄清透明，陰性藥管有紊絮狀混濁或豆腐渣樣凝塊。不同化學類型純露中，芳樟醇型純露的抑菌效果最好，對所有試驗菌的MIC 為250 μL/mL。其次抑菌效果較好的為油樟型和檸檬醛型樟樹葉純露，其對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC均為250 μL/mL，對大腸埃希菌、銅綠膿假單孢菌、枯草芽孢桿菌的MIC 均為500 μL/mL；油樟型樟樹葉純露的殺菌效果最好，其對供試細菌和真菌的MBC 為250 μL/mL。其次是芳樟醇型和龍腦型樟樹葉純露，其對枯草芽孢桿菌的MBC 為250 μL/mL，對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠膿假單孢菌、白色念珠菌的MBC 均為500 μL/mL。

表4 不同化學類型樟樹葉純露的MIC 和MBCTable 4 MIC and MBC of hydrosols from different types of Cinnamomum camphora leaves

3 討論

研究表明，樟樹葉揮發油主要含有1，8-桉葉油素、芳樟醇、松油醇、樟腦、龍腦和檸檬醛等［17-20,27］化學成分，具有一定的殺菌、消毒效果，是食品、香精香料和醫藥等行業的重要原料［21］。吳克剛等［28］研究發現芳樟醇具有較強的氣相抗菌活性。王新偉等［29］研究發現檸檬醛對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。桉葉油素可用于配制牙膏、化妝品、口香糖、驅風膏［30］等。馬英姿等［31］研究發現樟樹精油具有較好的抑菌效果，冰片（富含龍腦）具有很強的抗菌作用。而樟樹葉純露是提取精油后的副產物，也具有少量精油成分及活性物質，且產量大，易獲得，如今后可以在天然防腐保鮮、消殺產品等方面應用，將具有一定的潛在開發利用價值。

試管法抗菌試驗藥物直接接觸菌株，在有效濃度下，藥物活性成分即可以有足夠量進入菌體，抑制或殺滅菌，紙片法抗菌試驗有賴于藥物擴散并在紙片周圍形成有效藥物濃度，才能形成明顯抑菌圈，某些脂溶性成份在水溶性瓊脂培養基中的擴散性不是很好，所以會有樣品在試管法試驗中表現為有抑菌活性而在紙片法試驗中抑菌圈不明顯，此可以解釋油樟醛型純露在試管法具有很好的抑菌和殺菌作用，而在紙片法試驗中無明顯的抑菌活性，可能是純露的抗菌成分為脂溶性物質。

目前，對芳香植物純露的應用，有少數學者研究。高雅博［32］通過原料篩選、配方設計、性能評價及配方優化的研究確定了洗手液的基礎配方及工藝流程，研發了一款茶樹純露為特征成分的抑菌洗手液。于曉雪等［33］在蛋雞飲用水中添加茶樹純露，對蛋黃顏色、哈氏單位、蛋殼顏色等雞蛋品質指標進行檢測和分析，研究添加茶樹純露對雞蛋品質的影響，為茶樹純露用于改善雞蛋品質提供了參考。朱云娜等［34］在探討香茅純露對蔬菜種子萌發和幼苗生長的影響時，利用香茅純露對番茄、菜心種子萌發和幼苗生長均存在“低促高抑”效應，將香茅純露應用在蔬菜生產中。

本研究僅討論了樟樹葉純露的揮發性成分、理化性質和抑菌效果，研究仍不夠深入和全面，如果要將樟樹純露產品化，今后還要進一步對純露的抑菌機理進行研究和探討，以及開展對皮膚黏膜刺激性和人體毒性相關的研究。

4 結論

芳樟醇型樟樹葉純露的主要揮發性成分為芳樟醇，相對質量為74.03%；檸檬醛型樟樹葉純露的主要揮發性成分為橙花醛和香葉醛，相對質量分別為14.23%、29.26%；油樟型樟樹葉純露的主要揮發性成分為1,8-桉葉油素，相對質量為50.36%；龍腦型樟樹葉純露的主要揮發性成分為龍腦，相對質量為82.27%；芳樟醇型樟葉純露的抑菌效果最好，其對供試細菌和真菌的MIC 均為250 μL/mL，其次抑菌效果較好的為油樟型和檸檬醛型樟樹葉純露；油樟型樟樹葉純露的殺菌效果最好，其對供試細菌和真菌的MBC 為250 μL/mL，其次是龍腦型和芳樟醇型樟樹葉純露。

各種純露具有各自的特征氣味，都是弱酸性的，相對密度均>1.0000。不同化學類型純露的pH值和相對密度相差不大，其中龍腦型純露的pH值和相對密度稍高于其他類型純露，各純露的性質穩定。