紅葉粗肋草組織培養葉色影響因素研究

顧夢云，曾偉達，黃明翅，宿慶連，馮肖梅，劉艷艷，張雪蓮，周曉云

（廣州花卉研究中心，廣東 廣州 510360）

【研究意義】粗肋草（Aglaonema commutatum）是天南星科（Araceae）粗肋草屬（Aglaonema）多年生草本觀葉植物［1］，較耐蔭，觀葉觀賞期長［2］，作為家庭小盆栽廣泛用于室內。紅葉粗肋草是近年來國內較為流行的彩葉品種之一，因其葉片具有較大的紅色斑塊、中肋粗大、色彩鮮艷亮麗，能夠填補淡花季節室內外單調色彩的不足［3-4］，深受廣大消費者的喜愛，紅葉粗肋草的種植及市場前景看好。隨著紅葉粗肋草種苗產量的逐年增多，部分紅葉粗肋草品種種苗和成品盆花易出現葉色褪紅返綠、葉色紅艷程度不高等問題，極不利于紅葉類粗肋草品種的大量生產和推廣。紅葉粗肋草繁殖方式主要有分株繁殖、扦插繁殖和組培快繁等，分株、扦插這兩種傳統繁殖方式因有傷口處理不當容易受病原菌或病毒的重復感染［5］，繁殖速率也相應較低［6］；組培快繁日益成為粗肋草種苗供應的主要方式，但通過組培快繁方式繁育的紅葉粗肋草種苗的葉色和紅艷度一直存在不穩定性，成為粗肋草種苗繁殖和促進產業發展的限制瓶頸。因此，通過研究紅葉粗肋草在組織培養過程中影響葉色的因素，對保持其葉片色彩紅艷度、提高組培生產效率具有非常重要的意義。【前人研究進展】高等植物葉片中的光合色素主要包括葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮和花青素等［7］，所含色素的種類、比例和分布位置是影響其葉色變化的直接因素［8-9］，花色素苷是引起植物葉片呈紅色的主要物質［10］，其含量變化受植物自身遺傳特性［9］、營養物質含量［11］、外界環境光照［12-13］、溫度［14］、干旱脅迫［15］等因素影響。王萌等［10］研究發現園林樹木葉片呈現不斷變紅的趨勢，主要是由可溶性糖不斷積累促進花色素苷合成、花色素苷含量與葉綠素含量比值不斷上升造成的；徐莉莉等［11］發現初夏噴施0.3%KH2PO4溶液可促進紅葉桃葉片花色素苷含量的增加（保持紅色）；楊露等［12］發現充足光照更有利于紫葉風箱果葉片呈色。然而，研究影響紅葉類粗肋草葉色因素的相關報道較少，且主要集中在光照和溫度條件對彩葉粗肋草小苗和盆花［3,14］生長時期葉色的影響研究方面，而組織培養階段對其葉色穩定影響因素的研究尚未見報道。【本研究切入點】以紅葉的廣花紅粗肋草為研究對象，針對其組培快繁方式繁育種苗葉色和紅艷度存在不穩定性以及組培工廠化生產效率需進一步提高等問題，從紅葉粗肋草組織培養的增殖培養基、增殖方式和培養條件（光照）等方面，探究紅葉粗肋草組織培養過程中影響葉色的因素。【擬解決的關鍵問題】探討在組培環節保持其葉片色彩鮮艷程度的可行性，為進一步穩定紅葉類粗肋草高效組培技術及調控葉色提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料廣花紅粗肋草，為廣州花卉研究中心自主選育品種，組織培養材料均以廣花紅粗肋草莖段為外植體誘導而來。試驗于2019 年11 月至2021 年10 月在廣州花卉研究中心從化基地組培實驗室和溫室大棚進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 增殖培養基比較試驗 供試基本培養基包括MS、1/2MS、改良MS（NH4NO3含量減半）3 種，分別添加0、0.5、1.0 g/L K2SO4，共9 種培養基組合（表1）。每種培養基均添加0.2 mg/L KT、3.0 mg/L 6-BA、0.02 mg/L IBA、30 g/L 蔗糖和5.5 g/L瓊脂，pH 6.0。

將經過150 d 誘導的廣花紅粗肋草愈傷組織塊剪切成1.5 cm×1.5 cm 大小一致的方形小塊，每個小塊具4 個長1 cm 小芽，分別接種到9 種培養基中，每瓶4 塊，每個處理30 瓶。測量增殖分化的單株苗，每個處理測30 株，測量株高、葉長和葉寬，觀察葉色和葉形，將葉片中紅色斑塊剪出，用葉形紙稱重法計算紅色斑塊占葉面積比例（分＜ 20%、20%～50%、50%～80%、＞ 80% 4個等級）；將分化出的單株苗進行生根培養，40 d 后移植到溫室大棚種植，120 d 后統計成苗率。

成苗率（%）＝（葉色紅艷、生長狀況良好、無變異的正常苗株數/種植總株數）×100

1.2.2 增殖方式比較試驗 將滅菌后的廣花紅粗肋草外植體分別采用愈傷組織增殖、叢生芽增殖兩種增殖方式進行增殖擴繁，愈傷組織塊剪切成1.5 cm×1.5 cm 大小一致的方形小塊，每個小塊具4個長1 cm小芽，叢生芽每一叢具4個長1 cm小芽，每個處理10 瓶，后全部轉接生根培養，光照強度為3 000 lx，光照時間10 h/d，溫度25（±1）℃，40 d 后轉移到溫室大棚種植，120 d 后統計兩種增殖方式繁育苗的成苗率。

1.2.3 光照強度比較試驗 將增殖分化和生根培養階段的廣花紅粗肋草無菌瓶苗分別放在3 000、4 000 lx 的光照條件下培養，光照時間10 h/d，溫度25（±1）℃，每個處理30 瓶。增殖培養50 d后，測量增殖分化出的單株苗株高、葉長、葉寬，每個處理測定30 株；繼續轉生根培養40 d，觀察葉色，統計紅色斑塊占葉面積比例，然后全部移植到溫室大棚，120 d 后按1.2.1 方法統計成苗率。

1.2.4 光質比較試驗 設白光（LED 燈）、紅光、紅光∶藍光=7 ∶3、紅光∶藍光=5 ∶5、紅光∶藍光=3 ∶7、藍光、紫光共7 個處理，光照時間為10 h/d，溫度為25（±1）℃。將增殖分化和生根培養階段的廣花紅粗肋草無菌瓶苗分別放在以上7 種光質處理條件下培養，增殖培養50 d，每個處理30 瓶，然后繼續轉生根培養40 d。觀察組培苗葉色，取從上往下第1～2 片平展葉，測定葉綠素、花色素苷含量。其中，葉綠素提取和含量測定參照《植物生理生化實驗原理和技術》［16］方法，花色素苷提取和含量測定參照王佳婉［17］和劉曉東等［18］方法。

試驗數據采用Excel 2010 辦公軟件進行統計整理，利用統計分析軟件SAS 9.2 進行方差分析和多重比較（Duncan）。

2 結果與分析

2.1 不同增殖培養基對紅葉粗肋草增殖分化苗生長及葉色的影響

9 種不同的培養基配方增殖培養結果（表1）顯示，采用3 種不同基本培養基進行增殖培養（未添加K2SO4），MS 培養基和改良MS 培養基培養增殖分化苗的株高、葉長和葉寬均顯著高于1/2MS 培養基培養植株。其中，MS 培養基培養的增殖分化苗株高（3.44 cm）、葉長（3.29 cm）、葉寬（2.11 cm）均為最高；葉片紅色斑塊占比以1/2MS 培養基培養的最大，但該處理組培苗的成苗率最低、為66.67%，而改良MS 培養基培養的成苗率最高、為89.89%。增殖所用基本培養基配方對粗肋草增殖分化苗的生長量、葉色、組培苗成苗率均有影響，且MS 培養基和改良MS 培養基顯著優于1/2MS 培養基；1/2MS 培養基和添加0.5 g/L K2SO4的改良MS 培養基增殖分化苗的葉片紅色斑塊最多，但由于1/2MS 培養基增殖分化苗矮小且不夠健壯、成苗率最低，因此不適于增殖培養。

表1 不同增殖培養基對紅葉粗肋草增殖分化苗生長及葉色的影響Table 1 Effects of different culture medium on growth and leaf color of proliferation and differentiation seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

在同一種基本配方培養基中，添加0、0.5、1.0 g/L K2SO4對增殖分化苗的株高、葉長和葉寬的影響差異不顯著，但對分化苗葉片紅色斑塊占比和種植成苗率影響明顯。其中，1/2MS 培養基培養植株的紅色斑塊占比最大，但其種植成苗率均比其他兩種基本配方培養基低；且添加0.5 g/L K2SO4的改良MS 培養基分化苗的紅色葉片斑塊占比與1/2MS 培養基培養的一樣，種植成苗率則在所有配方中最高（90.00%）。

綜合上述分析，僅從穩定葉色上考慮，1/2 MS培養基和改良MS 培養基可用于紅葉粗肋草增殖培養，但改良MS 培養基成苗率顯著高于1/2 MS培養基，且種苗長勢整體優于1/2 MS 培養基，尤其是添加了0.5 g/L 的改良MS 培養基分化苗的葉片紅色斑塊較多，瓶苗植株健壯，種植成苗率最高，增殖培養能保持葉色紅艷度，綜合比較最優。

2.2 不同增殖方式對紅葉粗肋草增殖效率和組培苗生長及葉色的影響

由表2 可知，愈傷組織增殖方式前期經過3次轉接，于150 d 后誘導出愈傷組織，愈傷組織再經過2 次增殖培養，增殖系數為1.5～2.0，增殖培養100 d，共計250 d 后分化出芽，每個愈傷組織塊可分化出4～5 個芽，芽個數較多（圖1A）。叢生芽增殖方式，由外植體直接誘導出芽需50 d，后進行叢生芽增殖培養，增殖4 次，增殖系數為2.5～3.0，增殖培養200 d，共計250 d 后叢生芽較健壯（圖1B）。可見，愈傷組織增殖方式前期愈傷組織誘導時間較長，叢生芽增殖方式前期需要進行叢生芽增殖培養，培養250 d 后均可進入生根培養階段，兩種增殖方式的增殖效率差異不大。

從表2 和圖1 可以看出，經叢生芽增殖方式培養的紅葉粗肋草組培生根苗葉色優于愈傷組織增殖方式，叢生芽增殖方式的紅葉粗肋組培生根苗成苗率為83.33%，明顯高于愈傷組織增殖方式，且叢生芽增殖方式的組培生根苗穴盤種植后長勢較均勻，葉片紅艷度高的植株較多，整體葉色優于愈傷組織增殖方式。可見，通過叢生芽增殖方式，其組培分化芽較健壯，能更有效保持葉色穩定性。

表2 不同增殖方式對紅葉粗肋草增殖效率和組培苗生長及葉色的影響Table 2 Effects of different propagation modes on proliferation efficiency,tissue culture seedling growth and leaf color of Aglaonema commutatum with red leaves

圖1 不同增殖方式對紅葉粗肋草組培苗生長及葉色的影響Fig.1 Effects of different propagation modes on the growth and leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

2.3 不同光照強度對紅葉粗肋草組培苗生長量及葉色的影響

從表3 可以看出，3 000 lx 光照強度處理紅葉粗肋草組培苗的株高為3.42 cm，顯著高于4 000 lx 處理，其葉寬1.89 cm、葉長2.49 cm，葉寬/葉長0.77，均小于4 000 lx 光照強度處理；可見，3 000 lx 光照強度處理的組培苗植株較細高、葉面積較小，植株葉片偏長圓型，4 000 lx 光照強度處理的組培苗植株較矮壯、葉面積大、葉片偏圓。葉色方面，3 000 lx 光照強度處理的紅葉粗肋草生根苗葉片紅色偏淡，紅色斑塊占比較小（圖2A）；4 000 lx 光照強度處理的紅葉粗肋草生根苗紅色斑塊占比大，葉色較紅（圖2B）。移栽種植后，4 000 lx 光照強度處理的紅葉粗肋草生根苗種植成苗率為88.89%，明顯高于3 000 lx 光照強度處理。結果表明，4 000 lx 光照強度處理的紅葉粗肋草組培苗更加矮壯，生根苗葉片呈色更佳，種植成苗率更高，更適合用于紅葉粗肋草組培光照培養。

圖2 不同光照強度對紅葉粗肋草組培苗葉色的影響Fig.2 Effects of different light intensity on leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

表3 不同光照強度對紅葉粗肋草組培苗生長量及葉色的影響Table 3 Effects of different light intensity on growth and leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

2.4 不同光質條件對紅葉粗肋草組培苗葉色的影響

從7 個不同光質處理對紅葉粗肋草葉片光合色素含量的影響結果（表4）可以看出，經紅光照射的組培苗葉片葉綠素a+b 含量最高、為0.058 mg/g，與經白光、紫光照射的組培苗葉片葉綠素a+b 含量差異不顯著，但顯著高于其他光照處理；其葉片花色素苷相對含量最低、為0.056 Units/g，與經白光、紫光照射的組培苗花色素苷相對含量差異不顯著，但明顯低于其他光照處理。經紅光∶藍光=3 ∶7 照射的組培苗葉片葉綠素a+b 總含量最低、為0.037 mg/g，與經藍光照射的組培苗葉綠素a+b 總含量差異不顯著，均顯著低于其他光質處理；其葉片花色素苷相對含量最高、為0.399 Units/g，均顯著高于其他處理。結果表明，紅光不利于紅葉粗肋草組培苗葉片花色素苷的積累，葉色最差，葉片呈綠白色（圖3B）；藍光在一定光質比例條件下可促進組培苗葉片花色素苷的積累，其中紅光∶藍光=3 ∶7 處理的組培苗葉片花色素苷相對含量最高，葉色紅艷（圖3E），其次是純藍光、紅光∶藍光=7 ∶3、紅光∶藍光=5 ∶5 處理。

圖3 不同光質條件對紅葉粗肋草組培苗葉色的影響Fig.3 Effects of different light quality conditions on leaf color of tissue culture seedlings of Aglaonema commutatum with red leaves

表4 不同光質條件對紅葉粗肋草組培苗葉片光合色素含量的影響Table 4 Effects of different light quality conditions on photosynthetic pigment content in tissue culture seedling leaves of Aglaonema commutatum with red leaves

3 討論

植物組織培養采用的培養基中包含有植物所需的大量元素、微量元素、激素等，同時根據品種特性及生產實際進行優化，如大量元素減半的1/2MS 培養基、減少NH4NO3含量的改良MS 培養基、富K 的MS 培養基等。在本研究中，采用1/2MS 培養基增殖分化的紅葉粗肋草組培苗過于弱小、移栽淘汰率高，因此不適合用于紅葉粗肋草的增殖培養。大量元素除滿足植物生長外，對植株葉片色素含量也有一定影響，植物葉片中很大一部分氮結合在葉綠素中［19］，胡靜靜等［20］、孫澤晨等［21］研究表明，N 元素與黃連木、紅葉南天竹葉片中的葉綠素含量呈正相關，與其葉片中的花色素苷含量呈負相關；K 元素可以通過促進糖的合成和運輸，提高紅葉石楠葉片中的花色素苷含量［22-23］，李小康等［24-25］研究發現葉面噴施3‰KH2PO4后中紅楊葉片顏色更鮮艷。本研究采用增加0.5 g/L K2SO4的改良MS 培養基增殖培養紅葉粗肋草，結果發現增殖分化苗葉色紅艷，與上述研究結果較一致。

不同植物可采用不同的組培增殖方式。例如，紅掌一般通過誘導愈傷組織再分化不定芽方式進行擴繁［26］；黑果枸杞誘導愈傷組織的分化能力較弱，通過萌發基莖叢生芽的方式增殖效果更好［27］；粗肋草通過愈傷組織增殖和叢生芽增殖兩種方式均可進行增殖擴繁［28-31］，本研究中兩種方式的增殖效率表現大致相同，但通過叢生芽增殖方式增殖的芽更加健壯、生根苗葉片顏色更穩定、移栽成苗率明顯高于愈傷誘導增殖方式，這與劉麗鋒等［32］“以大花蕙蘭莖尖作為外植體，不經過愈傷組織誘導可直接誘導叢生芽，是一種變異率低的快繁方法”的結論相一致。

光照是影響彩葉植物呈色的重要環境因素，葉片中的色素含量和比例均受光照強度和光質因素影響［3,8］。周佐葡等［3］研究發現，在光照強度1 000～4 000 lx 范圍內，隨著光照強度增加，如意和煙花紅葉粗肋草小苗葉色越艷麗，這與本試驗結果一致。本研究發現，4 000 lx 光照強度處理的組培苗相比3 000 lx 光照強度處理的組培苗，葉片呈色更佳。王冬雪［33］研究表明紅光處理可以促進楓香幼苗葉片葉綠素合成，與本試驗研究結果相似，本研究表明紅光條件下，紅葉粗肋草組培苗葉片葉綠素總含量最高。范皓月［34］研究發現紅光最有利于紅葉腺柳葉片呈現紅色，藍光和綠光會促使紅葉轉綠，本試驗中紅光不利于紅葉粗肋草組培苗葉片花色素苷的積累，葉片呈綠白色，藍光在一定比例條件下可促進葉片花色素苷的積累，其中以紅光∶藍光=3 ∶7（30%R ∶70%B）處理葉片花色素苷含量最高，與范皓月結論不一致，這可能是由于不同植物的色素系統對不同波長范圍的光具有吸收特異性，從而使不同植物對不同光質的反應存在差異［35］。

本試驗研究雖然對紅葉粗肋草組織培養的增殖培養基、增殖方式和光照條件進行了葉色影響因素分析，但紅葉粗肋草的葉色穩定性還受自身遺傳特性影響，我們在紅葉粗肋草組織培養采用的外植體跟蹤調查中發現，采用不同批次外植體組織培養的紅葉粗肋草組培苗也存在一定差異，外植體遺傳性狀穩定是紅葉粗肋草品種進行穩定無性繁殖的前提，是保證后續紅葉粗肋草種苗和盆花生產質量的重要因素，本研究未涉及紅葉粗肋草葉色遺傳學研究，后期還應加強對紅葉粗肋草葉色基因調控的研究，結合現代生物技術手段，繁育出葉色更加穩定的粗肋草品種和種苗。

4 結論

綜上，紅葉粗肋草組織培養的增殖培養基、增殖方式、光照條件，均對其葉色有影響。增殖培養基選擇0.5 g/L K2SO4的改良MS 培養基，紅葉粗肋草增殖分化苗健壯，葉片紅色斑塊占比在80%以上，成苗率為90.00%；與愈傷組織增殖方式相比，叢生芽增殖方式能更有效保持紅葉粗肋草組培苗葉色穩定性，且組培苗移栽成苗率比愈傷組織增殖方式高12.22%；光照強度為4 000 lx，紅葉粗肋草組培苗紅色斑塊面積增大，移栽成苗率達89.99%；合理調節紅藍光比例，可增加紅葉粗肋草組培苗葉片花色素苷相對含量，其中紅光∶藍光=3 ∶7 光質處理最佳，葉片葉綠素總含量最低為0.037 mg/g，花色素苷相對含量最高為0.399 Units/g，葉色紅艷。