金芪降糖片治療2型糖尿病大鼠的血清代謝組學研究

時正媛 李京峰 寶麗 楊春靜 續茜橋 楊璐

摘要 目的：本研究采用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術，探討了金芪降糖片（JQJT）治療2型糖尿病（T2DM）的作用機制。方法：采用高糖高脂飲食聯合鏈脲佐菌素（STZ）誘導T2DM模型，檢測大鼠體質量、血糖等指標。利用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析對照組、模型組、陽性藥組、正常給中藥組、模型給中藥組大鼠的血清樣品代謝譜。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）對差異代謝物進行篩選和鑒別。結果：從血清中篩選出15個潛在的生物標志物，并利用Met PA構建了1條相關的代謝通路，即甘油磷脂代謝通路。在2型糖尿病（T2DM）大鼠血清中，溶血磷脂酰膽堿（LysoPC）（18∶0）和LysoPC（16∶1）等9種代謝物下調，LysoPC（18∶1）和LysoPC（20∶0）等6種代謝物上調。結論：金芪降糖片給藥組能使這15種潛在的生物標志物有良好的回調趨勢，推測金芪降糖片可能通過調節脂代謝紊亂而緩解T2DM的進程。

關鍵詞 金芪降糖片;2型糖尿病;代謝組學;超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜;血清;中藥;甘油磷脂代謝;生物標志物

Serum Metabolomics of Jinqi Jiangtang Tablets in Rats with Type 2 Diabetes Mellitus

SHI Zhengyuan，LI Jingfeng，BAO Li，YANG Chunjing，XU Xiqiao，YANG Lu

（Department of Pharmacy，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China）

Abstract Objective：This study aims to explore the mechanism of Jinqi Jiangtang Tablets（JQJT） in the treatment of type 2 diabetes mellitus（T2DM） by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS/MS）.Methods：To be specific，T2DM was induced in rats with high-sugar and high-fat diet and streptozotocin（STZ） and the body weight，blood glucose，and other indicators were detected.UPLC-Q-TOF-MS/MS was employed to analyze the metabolic profiles of serum samples in control group，model group，positive drug group，JQJT normal group，and JQJT model group.Principal component analysis（PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA） were used to screen and identify the differential metabolites.Results：Metabolic profiling revealed 15 metabolites as the potential biomarkers distinguishing rats in model group from those in control group.The metabolomics pathway analysis（MetPA） was applied to investigate the underlying metabolic pathways.A major metabolic pathway was glycerophosphatide metabolism.Nine metabolites such as LysoPC（18∶0） and LysoPC（16∶1） were down-regulated in T2DM rats，and six metabolites such as LysoPC（18∶1） and LysoPC（20∶0） were up-regulated.Conclusion：Moreover，the fifteen biomarkers of each administration group had a trend of returning to the levels in rats in control group.The significantly-altered metabolite levels indicated that JQJT can improve the progression of T2DM by alleviating lipid metabolism disorder.

Keywords Jinqi Jiangtang Tablets; Type 2 diabetes mellitus; Metabolomics; UPLC-Q-TOF-MS; Serum; Chinese medicine; Glycerophosphatide metabolism; Biomarker

中圖分類號：R587.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.00878CC4C84-3415-48A0-AF5B-E9BAD9193C12

2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）又稱非胰島素依賴型糖尿病，是一種代謝性疾病，由于胰島素缺乏導致機體代謝紊亂。目前糖尿病的治療方法很多，包括合理控制飲食、適度運動、藥物治療等[1-5]。降糖藥主要分為中藥和西藥。雖然中藥的降糖速度和療效不如西藥，但中藥在預防糖尿病并發癥的發生和發展方面有一定的優勢。因此，中藥治療糖尿病的機制越來越受到關注和重視[6]。

金芪降糖片（JQJT）源于孫思邈的《千金方》，是由黃連、黃芪、金銀花組成的純中藥制劑。它是中國醫學科學院藥物研究所根據傳統古方和現代藥理學實驗方法，通過對數百種中草藥和植物藥樣品進行實驗篩選、綜合比較和評價而研制成的[7-8]。循證醫學證明其治療非胰島素依賴型糖尿病的療效確切，并于1993年獲得衛生部科技進步三等獎。在西藥降糖效果不理想、不良反應多的背景下，中醫藥在臨床治療T2DM中發揮了重要作用。經過20多年的臨床檢驗，已成為國內治療T2DM的經典中成藥品種[9]。

代謝組學是對生物體內所有代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化關系的學科[10-11]。與藥理和生化指標比較，代謝組學可以提供更多關于機體內內源性物質的信息。因此，該方法在藥物代謝、藥物毒性篩選及作用機制等方面具有良好的應用前景[12-17]。代謝組學可以有效監測藥物與代謝途徑、生理病理變化的關系，結合臨床生化指標評價藥物對糖尿病的治療效果[18-19]。本研究采用基于超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術的代謝組學研究方法，鑒定T2DM大鼠血清中相關生物標志物，分析其可能的代謝途徑，探討JQJT對T2DM代謝紊亂的影響，從代謝組學的角度闡明JQJT的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級雄性SD大鼠[北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006]，6～7周齡，于IVC籠具飼養，4只每籠，實驗室環境溫度保持22 ℃，濕度保持50%左右。本研究已通過首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院倫理委員會的審批[倫理審批號：sjtkyll-lx-2021（4）]。

1.1.2 藥物 金芪降糖片（天津中新藥業集團股份有限公司，隆順榕制藥廠，批號：870016），二甲雙胍（上海源葉生物科技有限公司，批號：K17D9Y77394），鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ，大連美侖生物技術有限公司，批號：S0923A）。

1.1.3 試劑與儀器 一水合檸檬酸和二水合檸檬酸三鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170109，20161209）;10%水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130201）;LC-MS級乙腈（Thermo Fisher Scientific，美國，批號：212213），HPLC級甲酸（上海安譜實驗科技股份有限公司，批號：S1360050）;Acquity UPLC-Q-TOF液質聯用儀（Waters公司，美國，型號：Xevo G2-XS）;Milli-Q Integral 5.5 Kit（CN）純水儀（Millipore，美國，型號：Integral 5.5 Kit）;3K15低溫離心機（Merck Sigma-Aldrich，Darmstadt，德國，型號：3K15）;Forma 88000系列-86 ℃超低溫冰箱（Thermo scientific，美國，型號：88600）;代謝籠（Tecniplast，意大利，型號：2602）;羅氏卓越金采血糖儀、羅氏卓越金采血糖試紙[羅氏診斷產品（上海）有限公司，批號：477417]。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 80只大鼠適應性喂養1周后，隨機選取24只喂養普通飼料，另外56只喂養高糖高脂飼料4周后，大鼠按40 mg/kg空腹腹腔注射STZ溶液（由檸檬酸緩沖液新鮮配制），喂養普通飼料的大鼠同時注射等體積的檸檬酸緩沖液。于注射STZ溶液3 d后，取大鼠尾尖血測定空腹血糖（Fasting Blood Glucose，FBG）濃度，血糖值≥11.1 mmol/L認為造模成功。喂養普通飼料的24只大鼠分為正常對照組與正常給藥組，繼續喂養普通飼料，每天固定時間分別灌胃給予生理鹽水和中藥。將造模成功的T2DM大鼠（36只）隨機分為3組，每組12只，分別為模型組、陽性藥組、中藥組，均喂養高糖高脂飼料，每日固定時間按劑量灌胃給藥1次，持續4周。

1.2.2 給藥方法 JQJT研磨后用蒸餾水溶解，5.3 g粉末溶于10 mL蒸餾水中，按1 mL/100 g大鼠體質量給藥，給藥前搖勻。二甲雙胍1 g粉末溶于50 mL蒸餾水中，按1 mL/100 g大鼠體質量給藥。中藥組、正常給藥對照組：每日固定時間按劑量5.3 g/（kg·d）灌胃給予JQJT（按1 mL/100 mg體質量給藥）。陽性藥對照組：灌胃給予鹽酸二甲雙胍水溶液200 mg/kg（按1 mL/100 mg體質量給藥）。正常對照組、模型組：灌胃給予蒸餾水，按1 mL/100 mg體質量給藥。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 體質量記錄 給高脂飼料前，高脂飼料飼養4周后，以及給藥治療4周后稱體質量。

1.2.3.2 血糖記錄 高脂飼料飼養4周后、注射STZ 3 d后以及給藥治療3 d后測FBG值。

1.2.3.3 血樣收集 末次給藥后，隔夜禁食，以5%水合氯醛麻醉后，于腹主動脈取血，血樣在4 ℃條件下2 200×g，離心10 min，將分離得到的血清分裝，-80 ℃冰箱保存待測。

1.2.3.4 血樣前處理 將儲存于-20 ℃冰箱中的待測尿樣取出，置于室溫條件下，至樣品充分融化（1 h），將樣品置于渦旋振蕩器上震蕩5 min;吸取血清樣品50 μL置于1.5 mL塑料離心管中，然后取200 μL乙腈加入離心管中以沉淀蛋白，置于渦旋振蕩器上震蕩5 min，置于低溫離心機4 ℃，21 000×g，條件下離心20 min，將上清50 μL置于1.5 mL EP管中，加入150 μL稀釋液，渦旋混勻5 min，取混合后的樣品200 μL，待UPLC-Q-TOF-MS/MS測定。78CC4C84-3415-48A0-AF5B-E9BAD9193C12

1.2.3.5 QC樣品配制方法 分別吸取55個大鼠血清樣品各50 μL，置于10 mL塑料離心管中，渦旋混勻后，吸取50 μL置于離心管中，然后取200 μL乙腈加入離心管中以沉淀蛋白，置于渦旋振蕩器上震蕩5 min，置于低溫離心機4 ℃ 21 000×g，條件下離心20 min，將上清50 μL置于1.5 mL EP管中，加入150 μL稀釋液，渦旋混勻5 min，取混合后的樣品200 μL，待UPLC-Q-TOF-MS/MS測定。

1.2.3.6 UPLC-Q-TOF-MS/MS條件及樣本分析?? 色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm;Waters公司，美國，批號：0228393521）;進樣量：2 μL，柱溫：40 ℃，流動相：含0.1%甲酸的超純水（A相）和含0.1%甲酸的質譜級乙腈（B相），梯度洗脫條件：0～1 min，1%B;1～12 min，1%～55%B;12～14 min，55%～99%B;14～16 min，99%B;16～18 min，99%～1%B，流速：0.4 mL/min。質譜條件：采用電噴霧電離（Electrospray Ionization，ESI），離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，錐孔氣流速50 L/h，脫溶劑氣流速800 L/h，錐孔電壓40 V，正離子模式下毛細管電壓3 kV，負離子模式下毛細管電壓-2 kV。

1.2.3.7 非靶向代謝組數據處理 將所有采集的數據通過Progenesis QI軟件進行處理，包括原始數據導入、峰對齊、峰提取、歸一化等步驟，最終形成包括保留時間、質荷比和峰強度的表。反相色譜峰提取時間為1～18 min，對加氫、加鈉等各種添加劑離子進行去卷積處理。通過匹配人類代謝組學數據庫和脂質數據庫來鑒定代謝物。將所有樣本均吸取固定體積，混合均勻后，得到質控樣本，使用質控樣本評價樣品采集過程中系統的穩定性和重復性。質控樣品的前處理方法與其他樣品相同。首先取空白樣品5份進樣，用于平衡色譜柱，然后取6份質控品平衡色譜條件。每進6～8個樣品，插入1個質控品，以考察整個檢測體系的重復性和穩定性。并計算質控品中提取的代謝物色譜峰的變異系數，對變異系數超過30%的代謝物色譜峰進行剔除。

1.3 統計學方法

樣本的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）可以反映組內整體的變異性和樣本間的代謝差異。對數據集進行歸一化處理后，使用SIMCA-P 14.1軟件對其進行正式分析，以得到更直觀可靠的結果，歸一化的目的是使所有變量的標度（一些數字特征，如均值和標準差）處于同一水平，從而避免由于復雜生物樣品中不同代謝物濃度差異大導致的某些代謝物濃度過高，或過低代謝物的信號被掩蓋，進而影響生物標志物的鑒定。PCA是一種無監督性的模型分析方法，它可以根據數據的相似性對其進行歸類。因此，與偏最小二乘法判別分析（Partial Least Squares Discrimination Analysis，PLS-DA）等監督模型分析方法比較，PCA能夠更真實地反映組間差異，識別組內變異。為了獲得導致這種顯著差異的代謝物信息，我們進一步采用監督性的多維統計方法即OPLS-DA對2組樣本進行統計分析。

本研究在尋找差異表達代謝物的過程中，使用了t-test的P值（P<0.05）和OPLS-DA模型的VIP值（Variable Importance in the Projection）（閾值>1）。差異代謝物的定性方法如下：1）在線檢索數據庫（HMDB）（比較質譜的質荷比m/z或者精確分子質量mass，誤差限0.01 Da）;2）與本地的數據庫相結合。

2 結果

2.1 JQJT對模型大鼠進食、飲水及體質量的影響? 模型大鼠的進食量、飲水量和尿量比對照組均有顯著增加（P<0.01）。與對照組比較，模型組體質量明顯減輕，符合“三多一少”糖尿病的典型癥狀。與模型組比較，JQJT組和二甲雙胍組的癥狀均能明顯減輕（P<0.01）。

2.2 JQJT對模型大鼠血糖值的影響

模型組大鼠的血糖相比于對照組有明顯升高（P<0.001），證明造模成功，連續給藥4周后，各給藥組的血糖相比于模型組均有所下降（P<0.001）。JQJT組和二甲雙胍組大鼠的均有顯著下降，證明JQJT對T2DM大鼠有一定的治療作用（P<0.001）。

2.3 大鼠血清代謝組學分析

2.3.1 質控評估 首先使用無監督主成分分析（PCA）對QC樣本和其他實驗樣本進行分析。QC樣品成分相同，應在PCA得分圖中聚集。ESI正離子模式、負離子模式分離的PCA得分見圖1。樣本PCA反向色譜正離子和反向色譜負離子的結果見圖2。樣本OPLS-DA分析，反向色譜正離子、反向色譜負離子的結果見圖3。結果表明，該系統具有良好的重復性。

2.3.2 差異代謝物的篩選和鑒別 最后篩選出15個血清潛在生物標志物，對表LysoPE和LysoPC進行說明。見表1。

2.3.3 代謝通路分析 使用Met PA（https：//www.metaboanalyst.ca/）基于HMDB數據庫和KEGG，對代謝途徑進行分析，并通過代謝通路富集分析和拓撲分析的結果，找到最相關的代謝途徑。從中篩選出相關的差異代謝物共15種，其中一條重要的代謝途徑，確定為甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid Metabolism）。見圖4。樣品含量轉換成可視化的熱圖。見圖5。在JQJT組代謝物的含量回調，代謝途徑的紊亂得到改善，在代謝層面證明了JQJT對T2DM有較好的治療作用。

3 討論78CC4C84-3415-48A0-AF5B-E9BAD9193C12

JQJT治療糖尿病療效顯著，目前，已有研究探討了JQJT各成分的體外抗糖尿病作用及其機制[20-21]。然而，從內源性物質的角度來看，分析JQJT治療糖尿病的作用機制尚缺乏相關研究。代謝組學的分析目標越來越有針對性，從所有小分子代謝產物中篩選出與疾病具有明顯相關性的目標組分，不僅可以降低分析的難度、提高準確度，而且可以使生物標志物更容易用于臨床和藥物評價。本研究采用代謝組學的方法，研究了JQJT對T2DM大鼠代謝的影響。從JQJT給藥前后內源性物質的變化趨勢，探討其治療T2DM可能的代謝途徑，為中醫藥治療糖尿病的機制研究提供實驗參考，對充分認識藥物的性質，掌握其應用規律具有重要意義。

溶血磷脂通過激活特異的G蛋白偶聯受體，產生一系列生理和病理反應，是生物第二信使。溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺都是甘油磷脂的代謝產物，糖尿病與慢性腎病等代謝性疾病的患者血清中溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺的含量均有異常改變。統計學分析表明，這兩類脂質中間產物與糖尿病并發的炎癥、氧化應激和動脈硬化等密切相關[22]。模型組與對照組比較溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺含量均明顯上調或下調，揭示T2DM大鼠血清磷脂代謝紊亂，給予JQJT后，差異代謝物含量有不同程度回調。這些結果提示，JQJT治療糖尿病的潛在機制是調節甘油磷脂代謝紊亂。

綜上所述，代謝組學為中藥從分子水平研究治療疾病的機制提供了一種可行性的實驗方法。本研究利用非靶向代謝組學分析，探討JQJT對T2DM模型大鼠的治療作用及其機制。通過PCA和OPLS-DA模式識別分析，完成了組間的區分和對差異代謝物的篩選。篩選得到的差異代謝物主要參與甘油磷脂代謝途徑，提示JQJT主要通過調節脂質代謝紊亂來改善T2DM的病情。

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（2021-03-02收稿 本文編輯：吳珊）

基金項目：國家自然科學基金項目（82073741）——奇數碳溶血磷脂酰膽堿LPC（17：0）介導茯苓三萜C43改善2型糖尿病的機制學研究作者簡介：時正媛（1984.07—），女，博士，副主任藥師，研究方向：藥物代謝組學，E-mail：zhengyuan9999@126.com

通信作者：楊璐（1983.03—），女，博士，主管藥師，研究方向：臨床藥學，E-mail：yanglu0305@163.com78CC4C84-3415-48A0-AF5B-E9BAD9193C12