功能基因組學(xué)方法篩選蟾毒靈抗肝癌細(xì)胞的潛在凋亡靶點(diǎn)

林家茂 張晨月 部帥 李振祥 趙成龍 王海永

摘要 目的：篩選中藥單體蟾毒靈促進(jìn)人肝癌細(xì)胞凋亡的潛在分子靶點(diǎn)。方法：以人肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5為體外模型，觀察中藥單體蟾毒靈對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡以及相關(guān)基因表達(dá)的影響。以不同濃度的蟾毒靈分別作用于PLC/PRF/5細(xì)胞24 h、48 h、72 h，檢測其對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。通過高通量Illumina RNA測序，篩選蟾毒靈作用人肝癌細(xì)胞后基因表達(dá)的變化，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果：中藥單體蟾毒靈可抑制人肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡;中藥單體蟾毒靈可誘導(dǎo)不同基因的表達(dá);基因本體（GO）富集分析表明，中藥單體蟾毒靈可以影響細(xì)胞周期、凋亡等通路的變化;京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析凋亡通路表明，鈣離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑中的鈣蛋白酶表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)論：中藥單體蟾毒靈具有明顯的抗肝癌細(xì)胞凋亡作用，并可通過作用相關(guān)信號(hào)通路中的多靶點(diǎn)參與此過程。

關(guān)鍵詞 蟾毒靈;肝癌;增殖;凋亡;轉(zhuǎn)錄組學(xué);體外;基因表達(dá);生物信息學(xué)

Screening of Potential Targets of Bufalin against Hepatocellular Carcinoma Cells by Functional Genomics

LIN Jiamao1，ZHANG Chenyue2，BU Shuai3，LI Zhenxiang1，ZHAO Chenglong1，WANG Haiyong1

（1 Shandong Cancer Hospital and Institute，Ji′nan 250117，China; 2 Fudan University Shanghai Cancer Center，Shanghai 200032，China; 3 The Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250001，China）

Abstract Objective：This study aims to screen molecular targets of bufalin in promoting apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells.Methods：The effect of bufalin on apoptosis and gene expression of human hepatocellular carcinoma PLC/PRF/5 cells was investigated.To be specific，the PLC/PRF/5 cells were treated with different concentration of bufalin for 24 h，48 h，and 72 h，respectively，and the proliferation and apoptosis of the cells were detected.Illumina high-throughput sequencing of RNA was performed to observe the changes of gene expression in the cells treated with bufalin，and the bioinformation of related genes was analyzed.Results：Bufalin inhibited the proliferation and induced the apoptosis of PLC/PRF/5 cells.It induced the expression of different genes.Gene Ontology（GO） term analysis showed that bufalin influenced cell cycle，apoptosis，and other pathways.Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway analysis suggested that calpain was significantly up-regulated in calcium-induced cell death pathway.Conclusion：Bufalin remarkably promotes the apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells through multiple targets in related pathways.

Keywords Bufalin; Hepatocellular carcinoma; Proliferation; Apoptosis; Transcriptome; In vitro; Gene expression; Bioinformatics

中圖分類號(hào)：R273;R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.002

目前普遍認(rèn)為腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素所致的病理過程[1-2]。基因改變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因[3-4]。目前臨床中所用的許多化療藥物就是針對(duì)基因突變的分子而發(fā)揮良好的抗腫瘤功效[5-6]。

蟾毒靈是從中藥蟾酥中提取的最具活性的抗腫瘤成分，已被證實(shí)對(duì)多種腫瘤具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用[7-9]。研究表明，蟾毒靈可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和逆轉(zhuǎn)耐藥性[10-14]。然而，目前并沒有對(duì)蟾毒靈作用肝癌細(xì)胞后基因的變化進(jìn)行全面篩選的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究主要篩選并分析蟾毒靈對(duì)人肝癌細(xì)胞作用的潛在分子靶點(diǎn)。本研究使用Illumina RNA測序技術(shù)來檢測不同濃度蟾毒靈作用人肝癌細(xì)胞后相關(guān)基因差異表達(dá)情況，并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析。6CF65330-F464-4784-8903-A8464DAF226F

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 細(xì)胞 PLC/PRF/5細(xì)胞（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）。

1.1.2 藥物 蟾毒靈（Sigma公司，美國，批號(hào)：B0261）。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清（Hyclone公司，美國，批號(hào)：SH30084），青霉素/鏈霉素（Procell公司，批號(hào)：PB180120），二甲基亞砜（Sigma公司，美國，批號(hào)：D2650），胰酶（Gibco公司，美國，批號(hào)：25200-072），磷酸鹽緩沖液（Hyclone公司，美國，批號(hào)SH30256.01B），高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國，型號(hào)：SH30022.01B），細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK8試劑盒（Dojindo分子技術(shù)公司，日本，SKU：CK04），流式細(xì)胞儀（Beckman Counter，美國，型號(hào)：FC500），Annexin V-7AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（碧云天公司，批號(hào)：C1062）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)基由高糖DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素配制而成，放置于37 ℃含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到80%融合后傳代。溶于二甲基亞砜，稀釋至工作濃度（5 nmol/L，20 nmol/L）。用細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK8試劑盒測定細(xì)胞增殖。將PLC/PRF/5細(xì)胞按5 000細(xì)胞/孔密度接種于96孔板中。在37 ℃條件下，用5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L蟾毒靈分別處理細(xì)胞24 h、48 h、72 h，然后用CCK-8比色法測定細(xì)胞成活率。用微量平板閱讀器在460 nm處測量吸光度，以確定細(xì)胞成活率。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)胞周期分析 將PLC/PRF/5細(xì)胞接種于6個(gè)孔板中，每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞，在37 ℃下用5 nmol/L或20 nmol/L蟾毒靈孵育24 h，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌。進(jìn)行細(xì)胞周期分析[碧云天生物技術(shù)研究所，細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（C1052）]。隨后，細(xì)胞在4 ℃的70%甲醇中固定2 h，并用碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）[生工生物工程（上海）股份有限公司，E607306PI 染色試劑盒]染色，PI由0.5 mL染色緩沖液，25 μL的PI染色試劑（20×），10 μL的Rase A（50×）在37 ℃下染色30 min。使用流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長為350 nm的熒光，多周期AVDNA分析軟件（Version306;Phoenix Flow Systems，美國）。

1.2.3 細(xì)胞凋亡分析 將處于對(duì)數(shù)生長期的PLC/PRF/5細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，分別加入5 nmol/L和20 nmol/L濃度的蟾毒靈。以未經(jīng)處理的人肝癌細(xì)胞作為對(duì)照。處理72 h后，收集細(xì)胞，離心（1 000×g），用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液以2 000 r/min冷洗5 min，然后懸浮在100 μL 1×結(jié)合緩沖液中。接下來，將細(xì)胞與5 μL Annexin V和5 μL 7-AAD在25 ℃避光孵育15 min。最后，每個(gè)樣本注入400 μL的1倍結(jié)合緩沖液，進(jìn)行Annexin V-7AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測。然后用Cell Quest軟件評(píng)估細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用Annexin V/7AAD法檢測蟾毒靈處理的PLC/PRF/5細(xì)胞的凋亡率。用5 nmol/L和20 nmol/L蟾毒靈處理PLC/PRF/5細(xì)胞，檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Illumina HiSeq測序 按照Illumina TruseqTM RNA樣品制備試劑盒，使用5 μg總RNA制備轉(zhuǎn)錄組文庫;運(yùn)用磁珠法使用Epicentre Ribo-zeroTM rRNA Removal Kit（Epicentre，美國）分離mRNA后，用乙醇沉淀法清洗rRNA殘留物。其次通過TruseqTM RNA sample prep Kit進(jìn)行雙鏈cDNA合成、補(bǔ)平、3′端加A、連接Index接頭;通過TBS380 Picogreen進(jìn)行文庫富集，PCR擴(kuò)增15個(gè)周期;使用Bio-Rad 2%瓊脂糖膠回收目的條帶（Certified Low Range Ultra Agarose）;TBS380（Picogreen）定量，按數(shù)據(jù)比例混合上機(jī)后，使用cBot Truseq PE Cluster Kit v3-cBot-HS上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，生成clusters;最后在Illumina Hise4000測序平臺(tái)，進(jìn)行2×150 bp測序。

1.2.5 差異表達(dá)與功能富集分析 基于fpkm的計(jì)算公式使用Cuffdiff（http：//cufflinks.cbcb.umd.edu/）軟件，計(jì)算每2個(gè)樣品之間的表達(dá)差異，2個(gè)樣品之間的差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Gene，DEG）選擇標(biāo)準(zhǔn)為：使用差異倍數(shù)對(duì)數(shù)大于2且假發(fā)現(xiàn)率（False Discover Rate，F(xiàn)DR）小于0.05。我們通過利用Gotools（https：//github.com/tanghaibao/Goatools）和Kobas（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，以明確DEG的功能。通常情況下，經(jīng)過Bonferroni校正的DEG的P值<0.05時(shí)，認(rèn)為此GO功能和代謝通路存在顯著富集情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示來自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。使用方差分析，然后使用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組后配對(duì)比較，以分析3個(gè)以上組之間的差異。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6CF65330-F464-4784-8903-A8464DAF226F

2 結(jié)果

2.1 中藥單體蟾毒靈抑制人肝癌細(xì)胞增殖的作用呈濃度和時(shí)間依賴性

5 nmol/L蟾毒靈對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。隨著濃度的升高蟾毒靈抑制PLC/PRF/5細(xì)胞增殖作用更為明顯。80 nmol/L蟾毒靈孵育肝癌細(xì)胞72 h后，PLC/PRF/5細(xì)胞增殖能力最弱，總體而言，隨著蟾毒靈濃度增加，PLC/PRF/5細(xì)胞成活率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。見圖1。蟾毒靈抑制人肝癌細(xì)胞增殖具有時(shí)間和濃度依賴性。

2.2 蟾毒靈誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞的凋亡

細(xì)胞周期分析顯示，5 nmol/L和20 nmol/L蟾毒靈處理的人PLC/PRF/5肝癌細(xì)胞均被阻滯于G1期，經(jīng)蟾毒靈刺激后的人肝癌PLC/PRF/5細(xì)胞中G1期細(xì)胞比例略高于對(duì)照組。見圖2A。與未處理的細(xì)胞比較，5 nmol/L和20 nmol/L蟾毒靈作用后的肝癌細(xì)胞的凋亡率均升高。經(jīng)5 nmol/L蟾毒靈處理后的人肝癌PLC/PRF/5細(xì)胞凋亡率為5.9%，而20 nmol/L蟾毒靈孵育的人肝癌PLC/PRF/5細(xì)胞凋亡率為11.8%。與對(duì)照組比較，較低濃度（5 nmol/L）和較高濃度（20 nmol/L）蟾毒靈處理的人肝癌細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的凋亡。見圖2B。

2.3 蟾毒靈對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞基因表達(dá)的影響

結(jié)果表明，與未處理的細(xì)胞比較，低濃度蟾毒靈（5 nmol/L）、高濃度蟾毒靈（20 nmol/L）作用于肝癌細(xì)胞后，都可見基因表達(dá)的差異。在蟾毒靈處理的PLC/PRF/5細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)一系列基因表達(dá)上調(diào)和下調(diào)。總共有168個(gè)基因在5 nmol/L蟾毒靈處理的PLC/PRF/5細(xì)胞和未處理的PLC/PRF/5細(xì)胞之間發(fā)生了顯著的基因表達(dá)變化。此外，在20 nmol/L蟾毒靈處理的PLC/PRF/5細(xì)胞中，136個(gè)基因的表達(dá)與未處理的細(xì)胞比較發(fā)生了顯著的變化。與未處理的PLC/PRF/5細(xì)胞比較，經(jīng)5 nmol/L和20 nmol/L蟾毒靈處理的PLC/PRF/5細(xì)胞中，有20個(gè)基因的表達(dá)都發(fā)生變化。見圖3A。5 nmol/L蟾毒靈處理的細(xì)胞與未處理細(xì)胞，和5 nmol/L蟾毒靈處理的細(xì)胞與20 nmol/L蟾毒靈處理的細(xì)胞比較，47個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化。見圖3B。此外，比較5 nmol/L和20 nmol/L蟾毒靈處理的細(xì)胞中顯著改變的基因發(fā)現(xiàn)，338個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生變化。20 nmol/L蟾毒靈處理的細(xì)胞與未處理細(xì)胞，和20 nmol/L蟾毒靈處理的細(xì)胞與5 nmol/L蟾毒靈處理的細(xì)胞比較，有49個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化。見圖3C。此外，未處理的細(xì)胞和經(jīng)5 nmol/L或20 nmol/L蟾毒靈處理的人肝癌細(xì)胞表達(dá)差異的基因見圖3D。這個(gè)基因列表與圖3A～C中的基因有很大不同。上述結(jié)果表明，蟾毒靈可顯著改變?nèi)烁伟┘?xì)胞的基因表達(dá)。

2.4 蟾毒靈調(diào)控基因功能的富集分析

與未經(jīng)處理的肝癌細(xì)胞比較，20 nmol/L蟾毒靈處理的肝癌細(xì)胞具有與下列生物學(xué)過程相關(guān)：“正向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程”“正向調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)定位于膜”“正向調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組織”。見圖4A。另外，5 nmol/L蟾毒靈處理的人肝癌細(xì)胞與對(duì)照組比較，“細(xì)胞周期相變調(diào)控”“基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控”和“細(xì)胞大分子生物合成過程負(fù)調(diào)控”相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)生了顯著改變。見圖4B。5 nmol/L與20 nmol/L蟾毒靈處理的肝癌細(xì)胞比較，與“有絲分裂細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”“細(xì)胞酰胺代謝過程的調(diào)節(jié)”“視覺學(xué)習(xí)”和“對(duì)DNA損傷刺激的反應(yīng)的調(diào)節(jié)”相關(guān)的通路存在差異。見圖4C。

2.5 蟾毒靈促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的通路KEGG分析

蟾毒靈可引起多種凋亡相關(guān)蛋白以及通路的變化。在所有調(diào)控基因中，鈣離子誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑中的鈣蛋白酶表達(dá)明顯上調(diào)。見圖5。

3 討論

中藥單體蟾毒靈是從中藥蟾酥中提取的一種有效的抗腫瘤活性物質(zhì)，它能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。許多研究報(bào)道蟾毒靈抗腫瘤機(jī)制[15-18]。近年來，人們采用基因組水平的方法來研究抗腫瘤藥物的分子機(jī)制，如高通量測序方法、基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)策略和數(shù)據(jù)分析方法。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)蟾毒靈潛在靶點(diǎn)的全面分析，我們采用了高通量下一代測序技術(shù)。既確定了蟾毒靈的潛在靶點(diǎn)，又發(fā)現(xiàn)了蟾毒靈可能調(diào)控的分子通路。這些初步結(jié)果為進(jìn)一步研究蟾毒靈的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

癌變是一個(gè)受基因改變調(diào)控的過程[19-21]。基因表達(dá)的任何變化都會(huì)影響個(gè)體的生理功能。在目前的研究中，我們檢測了蟾毒靈作用人肝癌細(xì)胞后的基因。分析蟾毒靈處理細(xì)胞中的這些基因改變具有重要的價(jià)值。不可否認(rèn)，蟾毒靈也可誘導(dǎo)某些癌基因表達(dá)，抑制某些抑癌基因的表達(dá)。造成這種現(xiàn)象的原因有以下幾個(gè)方面：第一，蟾毒靈的作用在很大程度上依賴于其濃度。肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡取決于蟾毒靈作用的濃度。其次，沒有一種藥物可以上調(diào)所有的抑癌基因，也不能下調(diào)所有的癌基因。蟾毒靈的抗腫瘤作用是其對(duì)癌基因和抑癌基因作用的綜合整合結(jié)果。本研究檢測到蟾毒靈的幾個(gè)潛在靶點(diǎn)，可能為蟾酥等中藥治療肝癌的個(gè)體化治療提供基礎(chǔ)。根據(jù)本研究的數(shù)據(jù)，這些潛在的基因可能是有效的作用靶點(diǎn)，受影響的途徑也可能是潛在的干預(yù)途徑。

綜上所述，采用Illumina RNA測序的方法對(duì)蟾毒靈潛在的分子機(jī)制進(jìn)行了分析。獲得了對(duì)其靶點(diǎn)的概述和全面的視角，這將為蟾毒靈在抗肝癌進(jìn)展中的作用提供更好的視角和見解。

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（2021-03-11收稿 本文編輯：吳珊）

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018GSF119014）;山東省泰山學(xué)者基金資助項(xiàng)目（tsqn201812149）;山東第一醫(yī)科大學(xué)學(xué)術(shù)提升計(jì)劃項(xiàng)目（2019RC004）作者簡介：林家茂（1985.10—），男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤，E-mail：linjiamao_@126.com通信作者：王海永（1983.12—），男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤，E-mail：wanghaiyong6688@126.com6CF65330-F464-4784-8903-A8464DAF226F