金黃色葡萄球菌污染牛奶后的代謝產物研究

朱紅旭，衛 青，胡 昊，劉 靜，陶自偉*

（1.昆明理工大學 環境科學與工程學院，云南 昆明650500；2.云南同創檢測技術股份有限公司，云南 昆明650106；3.云南瑞升煙草技術（集團）有限公司，云南 昆明650106）

食源性致病菌因其種類多、分布范圍廣和生長環境易滿足等特點[1]，致使各類即食性食品在生產、加工和貯存過程中都極易沾染到致病菌[2]。據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）公告指出，每年發生的食源性疾病近數十億例，即使發達國家每年也至少有三分之一的人群患食源性疾病[3]。致病菌污染食品的問題已成為當下食品安全的難題。

食源性致病菌有好幾十種，其中最常見的有金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、空腸彎曲桿菌 （Campylobacter jejuni）、大 腸桿 菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、小腸結腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）、 副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）、李斯特菌（Listeria monocytogenes）等[4]。以往的致病菌的檢測方法（免疫檢測法，生物分子檢測法，傳感器檢測法）的檢測指標較為復雜，且結果往往具有局限性[5]。Nicholson J K等[6]在1999年提出了代謝組學的概念，讓代謝組學逐漸進入了大眾的視野。之后，許國旺等[7]和胡傳芹等[8]對代謝組學的機理以及在食品研究中的應用做了詳細的描述，至今，代謝組學已成為食品領域中食品安全的重要檢測手段[9]。這些研究為本研究運用代謝組學鑒定致病菌的特征代謝產物提供了理論基礎。

氣相色譜-質譜 （Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）因其分辨率好、靈敏度高、數據庫較為健全，近年來成為代謝組學的主要檢測方法[10-11]。作者選取牛奶為研究對象，并通過GC-MS鑒定金黃色葡萄球菌污染牛奶后的代謝物。同時，通過GC-MS檢測技術的代謝組學分析平臺探究了金黃色葡萄球菌在污染牛奶后的特征性和差異性代謝產物[10]。從小分子代謝物入手，尋找食物污染早期的差異性代謝物，以期能夠為金黃色葡萄球菌的典型代謝物的篩選提供參考，并為金黃色葡萄球菌污染牛奶后的潛在生物標志物篩選提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金黃色葡萄球菌金黃亞種（ATCC 6538）：購自中國普通微生物保藏管理中心；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）：購自美國西格瑪公司；二氯甲烷（色譜純）：購自美國邁瑞達公司；實驗用牛奶：購自昆明當地超市；營養肉湯培養基（蛋白胨10 g/L、牛肉浸出粉3 g/L、氯化鈉5 g/L）：購自百思生物公司，其固體培養基再加入20 g瓊脂粉，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH為7.0±0.5。

1.2 GC-MS鑒定代謝物

1.2.1 金黃色葡萄球菌的培養 將金黃色葡萄球菌株凍干粉接種入營養肉湯液體培養基復蘇，對復蘇后的菌液進行擴大培養，之后加入0.5 mL的菌液于0.5 mL的甘油溶液中（體積分數70%），置于-80℃冰箱中儲藏備用。取1 mL儲藏的菌液解凍后加到200 mL的營養肉湯液體培養基中，在37℃、150 r/min條件下培養24 h。上述實驗結束后，將菌液接種至營養肉湯固體培養基觀察是否有雜菌，若無雜菌即可進行后續培養實驗。取200 mL滅菌后的牛奶和1 mL菌液加入滅菌后的三角瓶中，在37℃、150 r/min條件下培養12 h。

1.2.2 代謝物的提取 取10 mL菌液于50 mL離心管中，再迅速加入10 mL-40℃冷凍的甲醇溶液（體積分數60%），然后置于-80℃冰箱中冷凍12 h進行淬滅。將淬滅后的冰凍樣品放于冷凍干燥機中進行凍干，凍干后的樣品再加入10 mL乙腈-甲醇-水溶液（體積比為2∶2∶1）萃取劑，振蕩后將溶液倒入帶有3種規格玻璃球的液體均質器中進行10 min的破碎。將破碎后的樣品置于37℃培養箱中靜置培養2 h，進行代謝物的提取。之后將反應后的溶液離心15 min（-4℃、10 000 r/min），取上清液，置于-80℃冰箱中凍藏12 h，再將冰凍樣品進行凍干，在測樣前加入2 mL二氯甲烷溶解之后可上機測樣。

1.2.3 頂空固相微萃取（HS-SPME）揮發性代謝物取10 mL培養后的菌液加入到頂空瓶中，用密封橡膠墊密封，待萃取。將75μm的CAR PDMS固相微萃取頭刺入頂空瓶中，在離液面2 cm處萃取30 min，萃取結束后立即上機檢測。

1.3 基因組測序

利用二代測序平臺（Illumina Hiseq×10平臺）對質檢合格的金黃色葡萄球菌的DNA樣品進行構建并插入約400 bp的片段，進行PE150（pair-end）測序（雙端測序），單端測序讀長150 bp，每個樣品提供不低于基因組100倍覆蓋深度的原始測序數據量，再對測序數據進行一系列分析。通過金黃色葡萄球菌的基因組信息構建代謝通路網絡，明確特征代謝產物的代謝途徑并對其做出解釋。

1.4 儀器與分析方法

1.4.1 儀器與設備 氣相色譜質譜聯用儀（7890N-5975C）：購自美國安捷倫公司，并配自動進樣器（A7683B）、MSD化學工作站和NIST 14.0數據庫；固相微萃取頭（75μm CAR-PDMS）：購自美國色譜科公司；高速冷凍離心機（Allegra X-15R）：購自美國貝克曼公司；冷凍干燥機（FDU-1200）：購自日本東京理化公司；試管分散機（UTTD）：購自德國艾卡公司；滅菌鍋（BXM-30R）：購自上海博訊公司；恒溫培養箱（MJ-70-I）：購自上海一恒公司。

1.4.2 GC-MS條件 DB-624毛細管色譜柱（60 m×320μm×1.80μm）；載氣：高純氦氣；流量：2.0 mL/min；柱溫升溫程序：初始溫度40℃，保持6 min，然后以10℃/min升溫至230℃，保持10 min。自動進樣1.0μL；采用不分流模式；進樣口溫度230℃。

質譜條件：離子源溫度230℃；接口溫度230℃；全掃描模式，質量掃描范圍29~350 m/z。

1.4.3 數據分析方法 原始數據經矩陣去噪和歸一化整理后放入Excel表；通過Agilent MSD Productivity Chem Station和NIST 14.0質譜數據庫確認各物質。通過SIMCA 14.1軟件對識別出的代謝物進行主成分分析 （Principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別（Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis，OPLSDA）分析，將OPLS-DA模型中的預測值（VIP＞1）的第一個主成分和單因素方差分析（P＜0.05）相結合，鑒定出主要的差異代謝物[12]。基因組序列信息通過KEGG genes和KEGG LIGAND數據庫進行比對，使用Gephi軟件構建代謝網絡圖，使用Origin8.6（Origin Lab Corp，Northampton，美國）進行圖形的繪制。

2 結果與分析

2.1 代謝譜圖與代謝途徑

2.1.1 代謝譜圖 金黃色葡萄球菌會充分利用食物中的營養物質進行生長，同時代謝出多種代謝物來污染食品，我們選取金黃色葡萄球菌接種牛奶后的代謝物進行檢測。由圖1可知，從下往上分別為6個牛奶樣品（MB）總離子流圖和6個金黃色葡萄球菌（M6538）的總離子流圖，總體上樣品的保留時間為20 min之前，比對每個峰的豐度后發現MB樣品和M6538樣品之間有較明顯的差異。具體對每個峰進行分析，得到N-甲硫基甲酰胺、1-丁醇、乙酸、乙苯、均三甲苯、辛酸、苯甲酸、正癸酸、十二烷酸是金黃色葡萄球菌樣品中獨有的揮發性代謝物質。

圖1 牛奶和金黃色葡萄球菌的總離子流（TIC）圖Fig.1 Total ion current (TIC)map of milk and Staphylococcus aureus

由圖2可知，從下往上分別為3個揮發氣體檢測的牛奶樣品總離子流圖和3個金黃色葡萄球菌的總離子流圖，樣品的保留時間超過20 min后出現較大差異。具體對每個峰分析可知，乙酸、乙醇、苯酚和丙二醇是金黃色葡萄球菌樣品中獨有的揮發性代謝物質。故此，總共篩選出12種潛在的差異代謝物，根據潛在差異物在各底物中的重現性，對其進一步分析。

圖2 頂空固相微萃取牛奶和金黃色葡萄球菌的總離子流（TIC）圖Fig.2 Total ion current (TIC)map of headspace solid phase microextraction for milk and Staphylococcus aureus

2.1.2 代謝物的代謝途徑 為明確金黃色葡萄球菌污染牛奶后的產生的差異代謝物的代謝途徑，并檢驗上述實驗的差異性和模型的可靠性，對其進行了主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法分析（Orthogonal partial least squares-Discriminant analysis，OPLS-DA）。PCA是代謝組學中最常用的分析方法[13]，首先通過將上述各物質的峰面積對照總表中的ID填入，刪除掉每組樣品出現率低于50%的物質數據。形成n個樣品對應m個物質的n×m矩陣。利用SIMCA進行數據分析，通過投影所有樣品殘差平方和得到一條體現樣品間最大差異的直線，重復此步驟，即可獲得樣品中最大且有序的差異[13]。OPLS-DA建模是通過檢驗2個樣品的穩定性再次區分2組樣品，在代謝組學中，分類信息解釋能力（R2Y）應大于0.5，同時R2Y和預測率（Q2）之間差不能超過0.2~0.3[14]。最后基于OPLS-DA模型做可變重要性（Variable importance，VIP）預測，VIP值大于1，即認為該物質是差異代謝物[15]。

圖3是牛奶和金黃色葡萄球菌PCA得分圖（a）和OPLS-DA得分圖（b），通過PCA分析，空白的牛奶（MB）和金黃色葡萄球菌污染的牛奶（M6538）中的物質在PCA圖中有明顯的分離，說明2組樣品有明顯的差異。圖3（b）說明，模型中兩組樣品（MB和M6538）分隔在兩邊，且模型的R2Y=0.946，Q2=0.891，兩者均大于0.5，且差值小于0.3，說明該模型穩定性強、預測性好。VIP預測值大于1的特征代謝產物為十二烷。根據潛在差異物在各底物中的重現性將乙醇、乙酸、均三甲苯、十二烷作為進一步分析的潛在差異代謝物。

圖3 牛奶和金黃色葡萄球菌的主成分分析得分圖和正交偏最小二乘判別得分圖Fig.3 Principal component analysis score map and orthogonal partial least squares-discriminant analysis score map of milk and Staphylococcus aureus

2.2 基因組測定

2.2.1 金黃色葡萄球菌的基因組測序 首先，由圖4可知，金黃色葡萄球菌基因組的GC含量為32.71%，且主要集中分布在圖中橙黃色區域，說明金黃色葡萄球菌樣本的污染程度極小，且測序的基因組質量良好。此外，大數據測序結果可知，金黃色葡萄球菌的全基因組序列全長2 753 789 bp，包含2 169個功能基因、40個tRNA、3個rRNA和389個未知基因。對得到的編碼基因進行功能KEGG注釋，見圖5。得到金黃色葡萄球菌的基因中代謝（metabolism）相關的基因有943個，細胞過程（Cellular Processes）相關的基因有83個，基因信息處理（Genetic Information Processing）相關的基因有172個，人類疾?。℉uman Diseases）相關的基因有100個，環境信息處理（Environmental Information Processing）相關的基因有214個，有機系統（Organismal Systems）相關基因有23個?？梢钥闯觯诮瘘S色葡萄球菌的基因里，主要是以代謝為主，有關復雜生命活動的基因比較少，其中又以碳水化合物的代謝（Carbohydrate metabolism）和全局概覽圖（Global and overview maps）的基因居多，分別有173個和167個基因。

圖4 金黃色葡萄球菌基因組GC_depth分布圖Fig.4 GC_depth distribution map of Staphylococcus aureus genome

圖5 金黃色葡萄球菌基因組的KEGG注釋Fig.5 KEGG annotation of Staphylococcus aureus genome

2.2.2 金黃色葡萄球菌的代謝系統分析 為更清晰地明確金黃色葡萄球菌的基因組信息，對金黃色葡萄球菌的基因數量、涉及的所有代謝通路和代謝通路之間的關系進行整理，之后使用Gephi軟件建立代謝網絡圖，構建了該菌株的代謝通路網絡且明確了特征代謝產物的代謝途徑。由圖6可知，不同顏色代表了不同的KEGG數據庫（http：//www.kegg.jp/）的代謝通路分類，每個節點的大小代表了與此途徑有關的代謝途徑數量，每條箭頭的指向表示一個代謝途徑中某物質進入下一個代謝途徑。金黃色葡萄球菌涉及的代謝通路有175個，代謝通路之間的相互關系共165條。說明金黃色葡萄球菌以基礎代謝為主，并直接或間接影響其他類別的代謝。其中糖酵解通路、三羧酸循環通路和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路最為活躍。在整個金黃色葡萄球菌代謝網絡中可以直接找到參與其中的代謝物分別是乙醇、乙酸、1-丁醇、甘油。具體的通路為丙酮酸經2-氧戊二酸/2-氧代酸鐵氧化還原酶亞基α（korA）或經丙酮酸脫氫酶組分E1（aceE）生成2-（α-羥乙基）硫胺二磷酸和S-乙酰二氫硫基賴氨酸，再經丙酮酸脫氫酶組分E2（aceF）產生乙酰輔酶A（CoA），乙酰輔酶A經乙酸-輔酶A連接酶（ADP）形成亞單位α（acdA），再生成乙酸，乙酸再由醛脫氫酶NAD+（ALDH）生成乙醛，最終乙醛由醛脫氫酶（ADH1_7）生成乙醇。在整個金黃色葡萄球菌代謝網絡中可以直接找到參與其中的代謝物分別是乙醇、乙酸、1-丁醇。

圖6 金黃色葡萄球菌代謝途徑關系網絡圖Fig.6 Metabolic pathway network of Staphylococcus aureus

進一步對金黃色葡萄球菌在乙醇和乙酸的代謝途徑關系進行分析，由圖7（a）可知，乙醇的產生則是只發生在糖酵解通路中。丙酮酸經2-氧戊二酸/2-氧代酸鐵氧化還原酶亞基α（korA）或經丙酮酸脫氫酶組分E1（aceE）生成2-（α-羥乙基）硫胺二磷酸和S-乙酰二氫硫基賴氨酸，再經丙酮酸脫氫酶組分E2（aceF）產生乙酰輔酶A（CoA），乙酰輔酶A經乙酸-輔酶A連接酶（ADP形成）亞單位α（acdA）生成乙酸，乙酸再由醛脫氫酶NAD+（ALDH）生成乙醛，最終乙醛由醛脫氫酶（ADH1_7）生成乙醇。糖酵解途徑影響了淀粉和蔗糖代謝通路、三羧酸循環通路、戊糖磷酸途徑和丙酸代謝通路。

圖7（b）可知，乙酸參與了糖酵解途徑、丙酮酸代謝通路、乙醛和二羧酸代謝通路、甲烷代謝通路和硫代謝通路。在糖酵解途徑中，乙酸是由乙酰輔酶A經乙酸-輔酶A連接酶（ADP）形成亞單位α（acdA）產生。在丙酮酸代謝途徑中，乙酸是由乙酰磷酸酯在乙酸酯激酶（ackA）或乙酰磷酸（acyP）酶作用下產生；也可以由乙醛經醛脫氫酶NAD+（ALDH）生成；也可由乙酰輔酶A經由兩次乙酰輔酶A合成酶（acs）產生。在乙醛和二羧酸代謝通路里，乙酸屬于參與者，主要作用是乙酰輔酶A的原材料。在甲烷代謝通路中，由乙酰輔酶A經由乙酰輔酶A合成酶（acs）在乙酸酯激酶（ackA）作用下生成乙酸。在硫代謝通路中，乙酸是由硫化物經半胱氨酸合酶/O-磷酸絲氨酸巰基酶/胱硫醚β合酶（cysO）生成。在金黃色葡萄球菌中，乙酸參與的丙酮酸代謝通路影響了纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路和生物合成通路，也影響了脂肪酸合成通路和乙醛和二羧酸代謝通路；乙醛和二羧酸代謝通路影響了丙酮酸代謝通路、糖酵解通路和三羧酸循環通路。

圖7 金黃色葡萄球菌乙醇代謝途徑和乙酸代謝途徑關系圖Fig.7 Graph of ethanol metabolic pathway of Staphylococcus aureus and acetic acid metabolic pathway

此外，1-丁醇只在丁酸代謝通路里由丁醛經丁醇脫氫酶（bdhAB）作用下加氫生成，未在代謝通路中直接找到均三甲苯和十二烷的代謝途徑。據研究表明，均三甲苯和十二烷對動物、環境具有一定的毒性[16-17]。綜上所述，通過對金黃色葡萄球菌污染牛奶后的代謝物進行分析后，明確了金黃色葡萄球菌的代謝產物可能具有的環境毒性和對人類的危害性，其分析結果可為今后判斷金黃色葡萄球菌污染食品產生的潛在特征物質提供參考。

3 結語

通過代謝組學研究方法清晰區分了被金黃色葡萄球菌污染牛奶的差異代謝物，篩選得到的N-甲硫基甲酰胺、1-丁醇、乙酸、乙苯、均三甲苯、辛酸、苯甲酸和正癸酸、十二烷酸、乙醇、苯酚、丙二醇為本研究的潛在差異代謝物。通過模型計算得出具有差異代謝物特征的為乙醇、乙酸、均三甲苯、十二烷。之后，結合代謝組學和基因組信息，通過構建代謝網絡，明確了乙酸、乙醇和1-丁醇在金黃色葡萄球菌種的代謝網絡中的代謝過程和作用。十二烷和均三甲苯也可作為金黃色葡萄球菌特殊的揮發性物質。此研究為今后快速檢測食品中金黃色葡萄球菌污染提供了借鑒方法。