枯草芽孢桿菌產D-阿洛酮糖3-差向異構酶的發酵優化

卜一凡，張 濤，2，陳靜靜，2，江 波*，2

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2.江南大學 食品安全國際聯合實驗室，江蘇無錫214122）

D-阿洛酮糖分子式為C6H12O6，是一種稀有糖。由于具有較低的熱量但卻有蔗糖70%的甜度，它為糖尿病人和肥胖人群提供了傳統糖制品的替代品，因此，D-阿洛酮糖備受關注[1]。D-阿洛酮糖在自然界中少量地存在于甘蔗、小麥等植物中[2-3]；化學合成法制備D-阿洛酮糖由于較多的副產物、復雜的純化步驟而受到限制[4]；而通過D-阿洛酮糖3-差向異 構 酶 （D-psicose 3-epimerase，EC 5.1.3.30，DPEase）催化D-果糖生產D-阿洛酮糖有許多優勢，例如簡單的純化過程和較高的產物濃度等[5]。枯草芽孢桿菌是一種食品級微生物，非致病性，且擁有高效分泌蛋白質的能力[6]，常用在抗生素、酶制劑的制備中。本研究所用的Bacillus subtilis1A751/pUB-P43dpe-dal[1]為作者所在實驗室前期構建的具有雙啟動子、無抗生素抗性的基因重組枯草芽孢桿菌，在前期實驗中，其在Super-Rich培養基中的最高發酵酶活為6 U/mL。

該研究目的是利用此基因重組菌Bacillus subtilis1A751/pUB-P43dpe-da在3 L發酵罐水平上進行產DPEase的發酵優化，獲得最適培養條件后進行補料培養來提高酶蛋白質表達量，以期為工業化制備D-阿洛酮糖提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.2 培養基

1）固體平板培養基（組分g/L） NaCl 10.0、蛋白胨10.0、酵母膏5.0，瓊脂粉20.0；調節pH 7.0。

2）種子液體培養基（組分g/L） NaCl 10.0、蛋白胨10.0、酵母膏5.0；調節pH 7.0。

3）發酵培養基（組分g/L） 葡萄糖15.0、酵母膏20.0、蛋白胨10.0、NaCl 8.0、MgSO4·7H2O 1.0、Na2HPO4·12H2O 1.0。

1.1.3 主要試劑及儀器 葡萄糖、MgSO4·7H2O、NaCl、瓊脂粉、Na2HPO4·12H2O、氨水、鹽酸：購自國藥集團；果糖：購自上海生工生物工程有限公司；酵母膏、蛋白胨：購自北京奧博星生物技術有限責任公司；其他試劑均為國產分析純。

Waters e2695高效液相色譜：美國Waters公司產品；DASGIP四聯3 L發酵罐：德國Eppendorf公司產品；MiniSpin離心機：德國Eppendorf公司產品；DK-8D電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品；A360紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司產品。

1.2 培養方法

1.2.1 菌種活化與發酵罐培養 接種環蘸取甘油管保藏的菌種，平板固體培養基劃線，37℃培養12 h。挑取單菌落轉接入液體培養基中（裝液體積分數10%），37℃、200 r/min培養12~14 h。將種子液按體積分數3%轉接入已含發酵培養基的3 L發酵罐中。將攪拌速率、通氣量關聯溶氧值，以攪拌速率1 000 r/min、通氣量2 vvm調節溶氧值為100%。發酵過程中定時取樣測定OD600、酶活、葡萄糖質量濃度。

網絡課程制作是一項系統工程，它涉及眾多專業、各個領域，專業性較強。繼續教育學院應安排專人負責，可以通過校內、校外公開招聘的形式，甚至可以直接聘請具有豐富教育教學經驗的專業教師，組建教師隊伍，為網絡教學資源建設提供師資保障。并且要加強課程設計與制作人員的學習與培訓，為網絡教學課程建設提供技術支持。

1.2.2 發酵指標測定

1）菌體生長量的測定 調節分光光度計波長為600 nm，將所得的發酵液樣品稀釋至適宜的濃度，置于比色皿中讀數，記錄吸光值。

2）DPEase酶活的測定 取發酵液樣品1 mL，12 000 r/min離心5 min，沉淀用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.5）反復洗吹、離心3次，將菌體沉淀稀釋至合適的濃度后，加到終體積1 mL用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.5）配制的果糖底物溶液中（果糖質量濃度90 g/L，Mn2+濃度為1 mmol/L），55℃保溫反應10 min，煮沸滅酶5 min后于12 000 r/min離心5 min，上清液過0.22μm濾膜，制樣，HPLC分析。酶活定義：在55℃、pH 7.5條件下，每分鐘內催化合成1μmol的D-阿洛酮糖所需的酶量為一個酶活單位（U）。

3）葡萄糖質量濃度的測定 取發酵液樣品1 mL，12 000 r/min離心5 min，上清液稀釋至合適的濃度后過0.22μm濾膜，制樣，HPLC分析。

1.2.3 溶解氧（DO）對發酵的影響 在發酵過程中，分別控制DO為20%、30%，在初始碳源質量濃度為15 g/L、pH自然、37℃的條件下進行發酵，定時取樣測定OD600值、酶活及葡萄糖質量濃度。

1.2.4 pH對發酵的影響 在發酵過程中通過流加14%氨水和13%鹽酸控制pH，分別控制pH在6.0、7.0及自然；通過流加體積分數14%氨水控制pH≥6.0，在初始碳源質量濃度為15 g/L、溫度37℃、DO為30%條件下進行發酵，定時取樣測定OD600、酶活及葡萄糖質量濃度。

1.2.5 溫度對發酵的影響 分別控制溫度28、37、42℃，在初始碳源質量濃度15 g/L、pH 6.0、DO為30%條件下進行發酵，定時取樣測定OD600值、酶活及葡萄糖質量濃度。

1.2.6 初始碳源質量濃度對發酵的影響 設置發酵培養基中初始葡萄糖質量濃度分別為15、20、25 g/L，在溫度37℃、pH 6.0、DO為30%條件下進行發酵，定時取樣測定OD600值、酶活及葡萄糖質量濃度。

1.2.7 補料時機對發酵的影響 在溫度37℃、初始碳源質量濃度15 g/L、pH 6.0、DO為30%條件下進行發酵，分別在第4、5、6、7小時進行補料，流量30 mL/h，補料瓶成分為540 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O，即碳源補料速率為16 g/（L·h），定時取樣測定OD600值、酶活及葡萄糖質量濃度。

1.2.8 補料碳源速率對發酵的影響 在溫度37℃、初始碳源質量濃度15 g/L、pH 6.0、DO為30%條件下進行發酵，第5小時進行補料，流量30 mL/h。補料瓶成分分別為135 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O、270 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O、400 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O、540 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O，即碳源補料速率分別為4、8、12、16 g/（L·h），定時取樣測定OD600值、酶活及葡萄糖質量濃度。

2 結果與分析

2.1 DO對發酵的影響

有研究表明，DO值較低時影響菌體代謝，而過高的DO值雖然可以使菌體迅速生長，但是容易導致菌體衰老，產量下降[7-9]。枯草芽孢桿菌是好氧菌，控制發酵過程的中的DO值對于菌體發酵和產酶具有重要作用[10]。圖1顯示了DO值分別為20%、30%和DO自然時對發酵的影響。可以看出，未控制體系DO時，OD600值增長緩慢，菌體生長受限，同樣也不利于產酶。而DO值為20%和30%的情況下，菌體得以生長并且產酶量增高。DO為30%時，酶活最高，因此選擇DO為30%作為最適DO條件。

圖1 DO對發酵的影響Fig.1 Effect of DO on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.2 pH對發酵的影響

pH可以影響菌體細胞膜的通透性和代謝，進而影響發酵進程[11-12]。分別控制發酵pH為6.0、7.0、pH自然和pH≥6.0，結果見圖2。在pH 6.0和自然的條件下，菌體增長較為緩慢，但在pH 6.0條件下6 h達到最高酶活，為78.3 U/mL。在pH 7.0條件下，菌體量達到最大后驟降，可能是由于流加的鹽酸、氨水量破壞了菌體。在維持pH≥6.0的條件下，碳源耗盡之后pH開始增加，發酵罐系統停止補充氨水，體系體積不再增長，使得測試的菌體量和酶活都出現了“二次增長”的現象。重組菌在4種pH控制條件下達到的最高酶活分別為78.3、62.3、46.3、42.4 U/mL，所以選擇pH 6.0作為最優的發酵pH。

圖2 pH對發酵的影響Fig.2 Effect of pH on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.3 溫度對發酵的影響

分別設置28、37、42℃以研究溫度對重組菌發酵過程的影響，結果見圖3。隨著溫度的升高，菌體的生長、酶活的升高、葡萄糖消耗速度都隨之加快。最高酶活出現在37℃的實驗組，溫度過高、過低都不適合菌體發酵，溫度過高會導致重組蛋白質的折疊紊亂進而形成包涵體[13]，長時間的高溫也會導致酶的失活。而較低的溫度使得菌體生長、產酶速度過慢。因此，選擇37℃為最佳的發酵溫度。

圖3 溫度對發酵的影響Fig.3 Effect of temperature on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.4 初始碳源質量濃度對發酵的影響

碳源對菌體發酵和產酶具有重要作用，是需求量最大的營養要素[14]。在確定最佳DO、pH和溫度后，分別設置發酵培養基中15、20、25 g/L的初始葡萄糖質量濃度。當初始葡萄糖質量濃度為15 g/L時，菌體生長和產酶較快，而質量濃度為25 g/L時，最高酶活僅為53.4 U/mL，但菌體增長情況與20 g/L的實驗組相似，見圖4。當培養基中碳源質量濃度過高時，菌體由于脫水而菌體量下降[15]，并且CcpA蛋白的產生會抑制酶蛋白的轉錄翻譯，酶活下降[15-18]。綜上，確定發酵培養基最適的初始葡萄糖質量濃度為15 g/L。

圖4 初始碳源質量濃度對發酵的影響Fig.4 Effect of initial carbon source concentration on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.5 補料時機對發酵的影響

在確定初始培養條件后，對發酵體系進行補料，其中葡萄糖和MgSO4·7H2O補料速率分別為16、0.6 g/（L·h），基于此條件對補料起始時間（4、5、6、7 h）進行了優化。由圖5可知，在發酵的第4、5、6、7小時分別對應發酵罐中葡萄糖的殘余質量濃度為10、4、0、0 g/L。3種補料方式中，從7 h起開始補料的實驗組結果較不明顯，這是由于補料時間太遲，菌體發酵過程中不利產物的積累一定程度上影響了菌體對補料的吸收。

圖5 補料時機對發酵的影響Fig.5 Effect of feeding time on cell growth，enzyme activity and glucose consumption during fermentation

當起始補料時間為4、6 h時，最高酶活僅為55.1、74.1 U/mL，低于未補料的酶活78.3 U/mL。而在第5小時開始補料，不僅在發酵過程中獲得了最高的酶活，且在后期酶活能夠維持在較高位，因此，較好的補料起始時間為第5小時。

2.6 補料碳源速率對發酵的影響

基于上述結果，較佳的補料時間為第5小時，分別設置葡萄糖補料速率4、8、12、16 g/（L·h），其中MgSO4·7H2O為0.6 g/（L·h）。如圖6（a），補料之后的菌體量均上升，最高OD600值由17.8上升至36.8。如圖6（b），補料組的酶活出現了“雙峰”的趨勢，這是由于補料的結果。當補料速率為12、16 g/（L·h）時，第6小時的酶活低于未補料的對照組，考慮到圖6（a）中6 h菌體量顯著高于對照組，說明此時酶活的降低可能并不是因為補料的稀釋作用，而是因為此速率補料對補料后1 h內的酶活產生一定的抑制作用。這兩種補料速率在中后期出現了葡萄糖的不斷積累，導致酶活低于補料速率為4、8 g/（L·h）的實驗組。而補料速率為4 g/（L·h）時，后期酶活也降至較低水平，結合圖6（c）中其葡萄糖質量濃度變化，推測酶活降低的原因為4 g/（L·h）補料速率不能滿足菌體對葡萄糖的需求，體系中葡萄糖耗盡未得到及時補充。當補料速率為8 g/（L·h）時，菌體在9 h達到最高酶活123.0 U/mL，并且酶活能夠長時間保持高位，因此選擇8 g/（L·h）的補料速率。

圖6 碳源補料速率對發酵的影響Fig.6 Effect of feeding rate on cell growth，enzyme activity and glucose consumption during fermentation

3 結 語

在對DO、pH、溫度、初始葡萄糖質量濃度進行優化后，確定了最適條件為：DO 30%，pH 6.0，溫度37℃、初始葡萄糖質量濃度15 g/L。該發酵條件下酶活為78.3 U/mL。在此基礎上進行補料培養，最適補料條件為：在發酵第5小時分別以8 g/（L·h）和0.6 g/（L·h）的速率流加葡萄糖與MgSO4·7H2O，在發酵第9小時達最高酶活，為123.0 U/mL，是優化前產酶能力的24倍。CHEN等[19]、FU等[20]通過枯草芽孢桿菌在7.5 L發酵罐中補料生產DPEase，獲得酶活分別為95 U/mL（84 h）、74 U/mL（72 h），發酵周期較長導致耗時和成本增加。而該研究中的發酵方法為工業化生產D-阿洛酮糖奠定了基礎，后續可對分段控制pH和DO值等進一步優化。