蟬花抑菌抗氧化譜效關系的初步研究

王 惠，陳 康，郝雯雯，陳義昌，于瑞蓮，林麗莎，韓燁楓

（南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京210046）

蟬花是一種蟲菌相依的組合體，是麥角菌科類真菌寄生在蟬類若蟲上的子座及若蟲的干燥復合體，屬于生物病態現象[1]，因其夏季成熟體頭部有類花枝樣物，故名蟬花。蟬花是一味傳統中藥材，性味甘寒，具散風熱、定驚鎮痙作用[2]。

現代大量研究證實蟬花含有多種活性物質，如多糖、核苷類、甾醇類、多球殼菌素、環肽類等物質[3]。這些成分具有抗氧化、抗腫瘤、提高機體免疫力、調節內分泌及治療白血病等作用，也是一種良好的自由基清除劑或自由基反應抑制劑[4-7]，分析蟬花的特定生物活性成分及藥理作用對其進一步開發是非常必要的。

由于野生蟬花菌種和生長環境差異，使得其品質參差不齊，主要的活性成分不明。國家有明文規定，開發新藥和食品等工業化產品時不得使用野生品種，使得人工蟬花的研究日益重要。與野生蟬花相比，人工培養的蟬花因全程無菌栽培，其中重金屬含量和種類遠低于野生蟬花，且孢子粉產量遠高于野生蟬花，是一種應用前景廣闊的藥食新資源[8-9]，見圖1。然而，目前針對蟬花的研究大多是藥理作用的傳統驗證研究[10-11]，或僅僅研究蟬花的化學成分[12-13]，將化學成分用色譜技術進行表征的“譜”與合適藥理指標的“效”結合的還很少。本課題組前期研究發現，人工蟬花具有良好的治療腸炎與腸道黏膜修復活性，因此，通過所在實驗室制備的不同培養批次人工蟬花建立超高效液相指紋圖譜，結合與抑制腸道炎癥和黏膜修復活性有關的抑菌抗氧化藥效指標進行灰色關聯度分析，篩選活性成分，為蟬花藥材的活性成分研究及開發提供參考。

圖1 野生和人工蟬花的比較Fig.1 Comparison of the leaves of wild and artificial Isaria cicadae Miquel(Ic M)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同批次蟬花：作者所在實驗室培養并鑒定為正品，信息見表1；蟬棒束孢菌：江蘇句容野生蟬花經菌種純化分離得到；金黃色葡萄球菌：江蘇省無錫質檢院饋贈；尿苷（批號：E2540025）、尿嘧啶（批號為：D4710010）、鳥苷（批號：H0170025）：購自上海安譜實驗科技股份有限公司；腺苷 （批號：KMO529CA14）、蟲草素（批號：RJ0730BA14）：購自上海源葉有限公司，所有對照品純度均＞98%；DPPH：購自南京建成有限公司；甲醇、乙腈為色譜級：購自TEDIA公司。

表1 人工蟬花來源信息表Table 1 Information table of artificially cultivated Ic M

1.2 儀器與設備

Ultimate3000型四元梯度分析兼半制備液相：美國賽默飛世爾科技公司產品；BSA224S型電子分析天平：德國賽多利斯公司產品；Q-500B型高速多功能粉碎機：上海冰都電器有限公司產品；SHZ-D（Ⅲ）型循環水真空泵：南京文科儀器設備有限公司產品；PST-JY-10型純水機：普力菲爾公司；KQ-500B型超聲波清洗機：昆山超聲儀器有限公司產品；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司產品；DNM-9602G型酶標儀：美國賽默飛世爾科技公司產品。

1.3 UPLC指紋圖譜的建立

1.3.1 色譜條件 Megres C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，5μm）；流動相水（A）-甲醇（D），梯度洗脫：0~5 min，5%D；5~20 min，5%~15%D；20~30 min，15%~30%D；30~40 min，30%~95%D；40~50 min，95%D；檢測波長254 nm；柱溫30℃；流量1.0 mL/min，進樣量10.0μL。按照上述色譜條件進樣，各出峰峰型良好，峰與峰之間分離度也良好。

1.3.2 人工蟬花制備 按照實驗室前期處理方法，將9批次不同時間制備的人工蟬花收集后，放入烘箱中于60℃烘干。干燥后樣品轉入旋風分離器中，分別收取孢子粉和孢子梗、培養基質[14]備用。用時進行粉碎處理，過80目篩。

1.3.3 溶液制備

1）對照品溶液制備 精密稱取尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺苷、蟲草素對照品適量，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解制成質量濃度為1 mg/mL的對照品儲備溶液，過0.22μm微孔濾膜備用。分別取對照品儲備液適量，加甲醇定容至5 mL，并逐級稀釋，得到一系列不同質量濃度的混合對照品溶液，于4℃供分析用。

2）供試品溶液制備 取各批次蟬花孢子粉和孢子梗細粉各1 g，置50 mL離心管中，加入10%甲醇25 mL，超聲處理1 h，趁熱過濾取上清液，過0.22μm濾膜，即得供試品溶液。

1.3.4 方法學考察 重復性考察、精密性考察及穩定性考察，樣品各峰保留時間及峰面積的RSD＜3.0%，說明該法重復性、精密性及穩定性良好，可用于建立人工蟬花的指紋圖譜。

1.3.5 指紋圖譜的建立 制備供試品溶液，在色譜條件下進樣，孢子梗部位以S1樣品為參照，孢子粉部位以S10用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2004版）進行共有峰的匹配。

1.3.6 質量濃度測定 制備供試品溶液，在色譜條件下進樣，記錄不同質量濃度對照品的峰面積，利用相關線性方程分別計算供試品溶液5種目標成分的質量濃度。

1.4 藥效試驗

作者所在實驗室在前期研究中發現[15]，蟬花對5-氟尿嘧啶造成的小鼠結腸黏膜損傷有一定的修復作用，而黏膜損傷和自由基含量過多有一定關聯，大多數化膿性球菌都屬于革蘭氏陽性菌，其感染以外傷、接觸、糞口感染為主，能產生外毒素使人致病。因此我們選擇有代表性的金黃色葡萄球菌在pH 8的生理條件下以及DPPH自由基清除抗氧化試驗來聯合探索蟬花與藥效間的關聯。

1.4.1 抑菌實驗

1）樣品液制備 在前人研究基礎上進行改進[16]，結合預試驗結果，得出蟬花質量濃度≥0.1 g/mL時抑菌效果良好，故將供試品溶液進行濃縮，使其質量濃度達到0.1 g/mL，再分別取1 mL用質量分數10%的碳酸鈉調至pH 8，以pH 8的碳酸鈉溶液為空白對照，在超凈工作臺上經微孔濾膜（0.45μm）濾過，即為抑菌樣品液。

2）培養基及指示菌懸液的制備 稱取6.6 g營養瓊脂于200 mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15 min，冷卻至46℃備用。稱取0.9 g營養肉湯溶解于50 mL蒸餾水中，在121℃下高壓滅菌15 min，得營養肉湯培養基。然后用接種環挑取一環金黃色葡萄球菌于裝有50 mL營養肉湯液體培養基中，在27℃搖床下振蕩4 h，制成菌懸液，備用。

3）抑菌圈半徑測定 在超凈工作臺上用移液槍吸取0.2 mL菌懸液于平板上，將培養基倒入培養皿中，迅速搖勻，等待其凝固。采用“濾紙片法”，用鑷子將無菌的直徑為6 mm的雙層濾紙片取出貼在平板上，吸取20μL樣品液于濾紙片上。將培養皿置于37℃恒溫培養箱中培養24 h，測量抑菌圈大小。

1.4.2 DPPH抗氧化實驗

1）樣品液制備 基于王余宸銘等人[17]的研究，作者將蟬花孢子粉、孢子梗、培養基質部位樣品溶液冷凍干燥后，用體積分數10%甲醇復溶為質量濃度10 mg/mL的樣品溶液，以維生素C作為陽性對照，4℃冰箱保存待用。取DPPH固體1 mg溶于24 mL 10%甲醇中，超聲10 min，充分振搖使上下部分均勻。

2）DPPH測試液制備 取1 mL DPPH溶液，加入0.5 mL 10%甲醇稀釋后，使其吸光度在0.6~1.0。根據前期預試驗結果，采用同樣方法處理蟬花兩部位9批次。于96孔板中加入270μL DPPH和30 μL 10%甲醇溶液作為對照空白；其余每孔中分別加入270μL DPPH和30μL的蟬花孢子粉、孢梗束提取液（9批次）作為試驗組，每個樣品平行測3份，暗處放置30 min后在517 nm處測定吸光度。按照以下公式進行計算。

式中：A0為空白對照組吸光度值；A1為樣品組吸光度值。

1.5 譜效分析

1.5.1 聚類分析 采用SPSS 19.0軟件，以人工蟬花共有峰峰面積為變量，對數據進行標準化處理，采用組間平均聯接法，以夾角余弦為樣品相似度，對人工蟬花不同批次的兩個部位進行聚類分析。

1.5.2 灰色關聯度分析 兩個系統或者兩個因素間關聯性大小的量度稱為關聯度。灰色關聯度分析是根據因素間發展趨勢的相似或者相異程度，利用確定參考數據列和若干比較數據列的幾何相似程度，對不同因素間關聯度大小進行動態分析的一種度量方法。作者以蟬花抑菌圈半徑（cm）和抗DPPH值為參考序列，以指紋圖譜共有峰面積數據為比較序列，對孢子粉和孢子梗部位共有峰峰面積進行均一化處理，再通過DPS軟件中灰色關聯度程序（V3.0）將指紋圖譜共有峰數據分別與2組藥效數值進行關聯分析。

2 結果與分析

2.1 蟬花不同指紋圖譜的建立

2.1.1 指紋圖譜的建立 將9批次樣品制備供試品溶液，在色譜條件下進行測定，記錄各樣品的UPLC圖。將孢子粉和孢子梗樣品圖譜以cdf格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版）”，以2019.2.22批次樣品圖為參照圖譜，對保留時間進行多點校正，時間寬度為0.1 min，分別生成孢子粉和孢子梗部位的對照指紋圖譜，結果見圖2。

3.精益求精，力爭打造教、康、保三位一體整合服務模式的典范。教、康、保三位一體整合服務模式現階段還處于實踐階段，由于操作時間短，個案量和個案經驗都非常有限，在今后的工作中，莊園將會為更多孤殘兒童提供教、康、保整合的服務。通過實踐，不斷精進，打造出可以推廣的、較為先進的服務模式。

圖2 人工蟬花不同部位指紋圖譜疊加圖Fig.2 Fingerprint overlay of different parts of artificially cultivated Ic M

2.1.2 相似度評價及共有峰指認 按照色譜方法進樣，得到的指紋圖譜色譜峰分離度良好。人工蟬花孢子粉和孢梗束部位在2個部位的指紋圖譜來源于9批不同制備時間的人工蟬花樣品，并分別與其生成的對照圖譜比較。其中，蟬花孢子粉部位相似度較高，分別為0.942、0.988、0.958、0.980、0.975、0.989、0.988、0.982、0.980。孢梗束部位相似度分別為0.910、0.942、0.538、0.940、0.941、0.946、0.437、0.953、0.933。2019.3.1和2019.4.3批次孢梗束差別較大。其中孢子粉有28個共有峰，孢梗束有15個共有峰。通過對照品比對，發現4個成分在各批次樣品圖譜中均有發現，保留時間一致，故確定8號峰為尿苷，12號峰為蟲草素，11號峰為鳥苷，19號峰為腺苷，結果見圖3。

圖3 各成分UPLC圖譜Fig.3 UPLC chromatogram of each component

2.2 樣品質量分數測定

精密吸取一系列質量濃度的對照品標準溶液，進行進樣分析，以對照品的峰面積（Y）及相應的質量濃度（X，μg/mL）進行線性回歸，得到回歸方程，結果見表2。

表2 5種目標成分的回歸方程Table 2 Regression equations of five targeted constituents

根據相關線性方程，用Excel和Graph Pad軟件繪制，分別計算蟬花不同批次孢子粉和孢子梗中尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺苷、蟲草素的質量分數（μg/g）結果見表3和圖4~5。

圖4 蟬花不同部位各成分的百分比Fig.4 Percentage content of various components in different parts of Ic M

表3 蟬花不同部位各類目標成分質量分數Table 3 Content of various components in different parts of Ic M μg/g

由表3和圖4可知，不同采收時間的蟬花中5種活性成分質量分數具有一定的差異，其中孢子梗部位尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺苷的總質量分數整體高于孢子粉部位，而蟲草素質量分數二者較為接近。

由圖5可知，蟬花孢子粉和孢子梗部位所測成分中，尿苷質量分數較高，占所測總成分質量分數的一半以上，而尿嘧啶、尿苷、鳥苷、腺苷質量分數較低，孢子粉部位中尿嘧啶質量分數最低，占比為1.023 45%，而孢子梗部位中以蟲草素質量分數較低，僅占所測成分質量分數的0.985 26%。

圖5 蟬花不同部位中5種目標成分總質量分數的柱狀圖Fig.5 Histogram of total contents of five targeted components in different parts of Ic M

2.3 抑菌作用

蟬花不同部位對金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表4。

表4 人工蟬花不同部位對金黃色葡萄球菌的抑制作用結果Table 4 Inhibitory results of Staphylococcus aureus from different parts of artificial cultivated Ic M

由表5可知，蟬花不同部位提取液對金黃色葡萄球菌均有抑制作用，空白組（pH 8的碳酸鈉溶液）的抑菌圈直徑＜0.6 cm，基本認定無抑菌作用，而樣品液在pH 8時抑菌效果良好，且同一批次的人工蟬花孢子粉部位的抑菌效果要優于蟬花孢子梗部位。

2.4 自由基清除能力對比

從圖6可以看出，陽性對照組（維生素C）的自由基清除率可達86%~95%，人工蟬花清除自由基效果最高可達陽性對照的一半，孢子粉效果最佳。蟬花孢子梗和孢子粉部位對氧自由基均有一定清除能力，同一制備時間的人工蟬花孢子粉和孢子梗部位對氧自由基清除能力不同，均以孢子粉部位清除能力較好，其中2019.4.17批次孢子粉抗氧化最佳。從整體孢子梗各批次來看，2019.3.1和2019.4.3兩個批次孢子梗抗氧化能力較好。

圖6 蟬花不同部位DPPH清除率Fig.6 DPPH clearance rate in different parts of artificial cultivated Ic M

2.5 譜效分析

2.5.1 聚類分析 由圖7可知，人工蟬花兩個部位通過聚類分析法得到了良好的區分，其中孢子粉部位（S10-S18）被歸為一類，共有峰的相對峰面積均值較為統一；孢子梗部位與孢子粉部位區別明顯，可以較好地進行區別。在不同批次蟬花孢子梗中，不同制備時間帶來成分上的差異較為明顯，其中S1、S9、S4、S8、S5、S6、S2為一類，S3和S7為一類。此方法相較于蟬花相似度計算的結果更為直觀，兩種分析手段由此相互補充證實。

圖7 人工蟬花不同部位聚類分析Fig.7 Cluster analysis of different parts of artificial cultivated Ic M

2.5.2 灰色關聯度分析 將不同批次蟬花的兩個部位的共有峰面積與相對應的蟬花樣品液在pH 8條件下的抑菌圈直徑以及不同批次DPPH值相關聯，結果見表5。

由表5可以看出，一共得到了2組關聯度結果。對蟬花抑菌作用貢獻度較大的有2、5、11、19、23號峰（關聯度均大于0.85），對抗氧化作用貢獻度較大的有2、6、11、19、23號峰。綜合來看2、11、19、23號峰對人工蟬花抑菌和抗氧化的貢獻度都較大。

表5 人工蟬花不同部位共有峰數據與其藥效相關性Table 5 Correlation between the common peak data of different parts of artificial cultivated Ic M and its pharmacodynamics

3 結 語

采用人工蟬花進行譜效分析，目的不在于對其進行溯源，也不是對藥材的真假鑒別。一是目前有關蟬花的活性研究得到的有價值的活性成分信息很少，本研究的目的是想通過“譜”和“藥效”的結合來篩選出人工蟬花對藥效貢獻度大的關鍵性成分，以便為今后探究人工蟬花不同部位關鍵性成分的含量及活性研究提供基礎；其次也為了考察栽培蟬花質量的穩定性和一致性。結合指紋圖譜與聚類分析結果可知，9批次蟬花孢子粉的相似度較高，均大于0.90，即孢子粉樣品與批次相關性不大。但是蟬花和其他絲狀菌一樣，菌株在人工培養基上傳代，由于菌落形態和生長速率的改變等生物學性狀的變異，會導致產孢子梗能力和目標活性物質產量等生產性狀的退化現象，從而影響人工蟬花不同批次孢子梗產品的產量和質量，這也是導致孢子梗中有部分批次差異度比較大，從而被單獨聚類的原因之一。

前期研究發現，人工蟬花對腸道炎癥有快速的治療效果，但蟬花提取液并無明顯的體外抑菌活性，當pH調至8，可以達到良好的抑菌效果，說明蟬花的抗菌活性與pH值有關。微堿性條件同機體腸道部位pH值相近，前期的研究也證實，作者所在實驗室培養的人工蟬花對5-氟尿嘧啶造成的小鼠結腸黏膜損傷有快速修復作用，腸道黏膜損傷后會造成腸道炎癥，而腸道黏膜損傷和自由基含量過多有較大關聯。所以，在抗氧化指標方面，選用具有代表性的DPPH法來測定人工蟬花不同部位清除自由基的能力。作者所在實驗室栽培的人工蟬花在產生抑菌效果的同時不會對機體產生不良影響，這一點同抗生素的抑菌作用有著較大的區別。抗生素的抑菌與pH值無關，多是微生物產生或化學合成的具有抑菌或者殺菌活性的物質，且容易對機體造成不良反應，如腹瀉、惡心、頭暈等。而本研究中人工栽培蟬花在抑菌的同時不會對腸道功能造成不良影響。基于這些原因，選擇抑菌、抗氧化指標來對人工蟬花的藥效活性進行探究。此外，從不同批次蟬花不同部位的質量分數來看，蟬花孢子梗中尿嘧啶、腺苷、鳥苷、尿苷、蟲草素質量分數均值顯著高于孢子粉，且各批次的質量分數均有區別。然而在藥效實驗中，孢子粉對金葡菌的抑制效果和自由基清除效果均優于孢子梗。結合灰色關聯度結果可以推測，這5種活性成分需要合適的配比才能在蟬花抑菌和抗氧化中起到較為重要的作用，質量分數過高或者過低可能對藥效均有較大影響，比如孢子粉部位中尿嘧啶質量分數最低，而孢子梗部位蟲草素質量分數最低。

由灰色關聯度結果可以看出，不同指標對同一個特征峰會表現出各自不同的關聯度，這表明不同指標受到某一成分的調控作用有差異性。作者以2組關聯度的均值作為綜合關聯度來判斷共有峰對藥效的貢獻度，2、11、19、23號峰（關聯度均大于0.85）代表的化學成分是對蟬花抑菌抗氧化作用貢獻較大的成分，將孢子粉和孢子梗部位的上述共有峰的峰面積相加，占蟬花孢子粉部位峰面積的50%以上，表明這些峰所代表的化學成分在人工蟬花孢子粉中量較多，和藥效試驗部分的結果相符，即人工蟬花孢子粉部分表現出更好的抑菌抗氧化趨勢。但對于上述共有峰，目前從液相色譜比對中只確定了8、11、19號，分別是尿苷、鳥苷、腺苷，其他關聯度高的未知化學成分的結構有待后期研究。

另外，發現11、19、23號峰在蟬花孢子粉和孢子梗間、不同批次間峰面積減小時，2號峰面積增加，且2、11號峰增減最為明顯，而與其臨近的1、10號峰峰面積也相應變化。這幾個共有峰對抑菌抗炎作用的貢獻度都較大，推測這些配對峰在蟬花生長過程中，不同的部位可能發生了轉化[18]，比如從孢子萌發和菌落生長速度看，其最佳溫為24~26℃。但孢梗束生長溫度有明顯偏低現象，24℃以上不能形成孢梗束[19]。

通過采用灰色關聯度分析法分析了蟬花抑菌抗氧化的藥效與化學成分之間的關聯度，但此法不能反映出成分對不同藥效的綜合貢獻度。所以在后期試驗中將灰色關聯度與主成分分析法結合使用，并對蟬花的體內藥效進行探究，即完整的體內體外藥效多重指標，以便客觀地體現各成分的作用和影響，為后期蟬花藥效物質研究提供思路。