糖原作為新型基因載體的研究

鄧淑豪，賴 莉，王志清，張慧杰，陳敬華

（江南大學 生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫214122）

基因治療是指將外源正常基因導入靶細胞，以修復有缺陷的基因或補償基因的缺失，從而達到疾病治療的目的。目前，基因治療在攻克腫瘤、糖尿病、遺傳性疾病和自身免疫性疾病等方面顯示出極大的潛力[1-2]。然而，未經修飾的目的基因不穩定，進入血液循環后極易被核酸酶降解。此外，目的基因在生理環境下一般帶負電荷，導致其難以進入靶細胞[3-4]。這些弊端都極大地影響到基因治療的效果。因此，構建安全高效的遞送載體對于基因治療至關重要。

常用的基因載體主要分為兩大類：病毒載體和非病毒載體[5]。病毒載體具有較高的基因遞送效率。然而，病毒載體制備過程復雜，同時，病毒載體存在免疫原性和潛在的安全性問題，這些因素嚴重制約了其臨床應用[6-7]。相對而言，非病毒載體制備簡單、免疫原性較低，同時載體結構設計豐富多樣，可有效提高目的基因的細胞轉染效率。非病毒載體主要以陽離子脂質體、陽離子聚合物為代表[8-11]。PEI 25k是目前研究最為廣泛的聚陽離子非病毒載體。盡管PEI 25k可以顯著提高目的基因的細胞轉染效率，但其自身較高的毒性限制了其發展。近年來，隨著納米生物技術的發展，利用各種納米材料、納米結構等構建的基因遞送系統受到了越來越多的關注。

糖原是由葡萄糖聚合而成的天然樹狀大分子多糖，是哺乳動物的貯備多糖，主要存在于哺乳動物的肝臟和骨骼肌中。作為內源性多糖，糖原無毒、無免疫原性。同時，糖原在體內可被淀粉酶和糖苷酶降解為葡萄糖[12]。糖原是天然的多糖納米材料，其粒徑大小約為20~150 nm[13-15]。糖原可溶于水，富含官能團，易通過化學修飾引入其他官能團[4]。糖原具有密集的支鏈，其樹狀大分子納米結構可以實現對藥物以及核酸等的高效負載。基于上述優異的性能，糖原在生物醫學領域的應用逐漸成為研究熱點[16-17]。

作者利用二乙烯三胺修飾糖原合成了氨基化的糖原衍生物（NH2-Gly），并對其作為基因載體的可行性和有效性進行了評估。利用動態光散射儀和紅外光譜對NH2-Gly結構進行了表征。采用凝膠電泳實驗分析其對pEGFP的負載和保護能力。通過MTT實驗和溶血實驗考察了NH2-Gly的生物相容性。最后，利用流式細胞術和激光共聚焦顯微鏡分析了NH2-Gly/pEGFP在NIH 3T3細胞內的轉染效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糖原（glycogen，相對分子質量100 000~110 000）：上海源葉生物科技有限公司產品；二乙烯三胺（DETA）：上海安耐吉化學有限公司產品；相對分子質量25 000聚乙烯亞胺：美國Sigma-Aldrich公司產品；綠色熒光蛋白質粒（pEGFP-N1）：北京TIANDZ公司產品，在大腸桿菌DH5α中大量繁殖，使用質粒抽提試劑盒抽提并純化；質粒抽提試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司產品；DNase酶、質量分數4%多聚甲醛固定液：上海生工生物工程股份有限公司產品；小鼠胚胎成纖維細胞NIH 3T3：來自中國科學院上海細胞庫；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、胰蛋白酶：碧云天生物技術公司產品；DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培養基、胎牛血清：美國Gibco公司產品；TAE緩沖液：武漢博士德生物公司產品；所需其他化學試劑（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 儀器與設備

Zetasizer Nano ZS動態光散射粒度儀：英國Malvern公司；凝膠成像儀：美國BIO-RAD公司；TENSORⅡ型紅外光譜儀：德國Bruker公司；AduanceⅢ型全數字化核磁共振波譜儀：德國Bruker公司；透射電子顯微鏡：日本JEOL公司；酶標儀：美國Bio-Rad公司；流式細胞儀：美國Beckman公司；Nanodrop One超微量紫外分光光度計：美國Thermo Fisher公司；高速離心機：德國Eppendorf公司；激光共聚焦顯微鏡：德國Leica公司。

1.3 研究方法

1.3.1 NH2-Gly的制備 首先按照質量比為1∶1~1∶10的比例分別稱取相應質量的糖原和羰基二咪唑（CDI）。在惰性氣體保護下，投入不同質量比的糖原與CDI，溶解于二甲基亞砜中；低溫攪拌1~4 h后，隨即加入一定質量的二乙烯三胺，持續反應12~36 h，得到氨基化糖原。隨后將上述所得溶液用去離子水透析3~5 d以去除有機溶劑等雜質，透析后將溶液放入冰箱冷凍24 h，然后用凍干機進行干燥，即得到氨基化糖原衍生物（NH2-Gly）。為測定二乙烯三胺在糖原上的取代程度，對NH2-Gly進行酸堿滴定。首先用去離子水配制25 mL 1 mg/mL的NH2-Gly樣品溶液，然后用酸堿滴定管進行滴定。先用HCl溶液（0.1 mol/L）滴定樣品溶液至pH為2.0，隨即用NaOH溶液（0.1 mol/L）滴定混合物，滴加的同時測量其pH，記錄pH隨滴定體積增加的變化情況，繪制滴定曲線，得到2個突變點。取代度根據公式（1）計算：

式中：DS為取代度；M為二乙烯三胺的相對分子質量；c為NaOH溶液的濃度，mol/L；m為NH2-Gly的質量，g；X1為第一個突變點的橫坐標，mL；X2為第二個突變點的橫坐標，mL。

1.3.2 NH2-Gly的pH緩沖能力測定 采用酸堿滴定法測定不同氨基化程度的NH2-Gly的pH緩沖能力及對照組PEI 25k在pH 2~11范圍內的緩沖能力。樣品溶液濃度為0.5 mg/mL，溶劑為NaCl溶液（0.1 mol/L），先用NaOH溶液（0.1 mol/L）滴定樣品溶液pH至11左右，然后將HCl溶液（0.1 mol/L）連續滴入溶液中并充分混勻，記錄pH的變化。

1.3.3 NH2-Gly的溶血性實驗 研究不同質量濃度NH2-Gly的溶血性。取1 mL小鼠血液于8 000 r/min下離心10 min以分離紅細胞，用pH 7.4的PBS洗滌5次至上清液澄清，用PBS稀釋重懸紅細胞。稱取一定量NH2-Gly樣品，并向不同樣品中分別加入200μL紅細胞懸液，其中NH2-Gly樣品溶液取800 μL（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0μg/mL）。另外，分別采用800μL PBS和水作為對照，PBS作為陰性對照（0%溶血），水作為陽性對照（100%溶血）。樣品放入37℃水浴鍋中孵育4 h后取出，2 000 r/min離心10 min，吸取100μL上清液加入96孔板中，用酶標儀檢測540 nm處吸光度。溶血率根據公式（2）計算：

式中：A為聚合物與血紅蛋白形成溶液的吸光度；A0為陰性對照溶液吸光度；A100為陽性對照溶液的吸光度。

1.3.4 NH2-Gly/pEGFP復合物的制備 取一定質量的NH2-Gly加入PBS中，攪拌使其充分溶解，得到相應質量濃度的NH2-Gly溶液。隨即按NH2-Gly與pEGFP的質量比（1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1）分別加入一定質量的pEGFP溶液，充分振蕩混勻，于4℃保存。取樣品溶液1 mL，采用動態光散射粒度儀測定NH2-Gly/pEGFP納米粒子的粒徑和表面電荷，測定溫度均為25℃。

1.3.5 瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗 按NH2-Gly與pEGFP的質量比（1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1）制備成NH2-Gly/pEGFP復合物，NH2-Gly/pEGFP含2.5μg質粒將所得復合物室溫靜置孵育1 h。吸取樣品或pEGFP溶液4μL（1μg），加入上樣緩沖液2μL，混勻。采用質量分數1%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析（100 V，30 min），用凝膠成像系統觀察凝膠并拍照，考察NH2-Gly對pEGFP的負載能力。

1.3.6 NH2-Gly/pEGFP的抗酶解實驗 按NH2-Gly與pEGFP質量比為5∶1和10∶1制備NH2-Gly/pEGFP復合物，復合物含5μg質粒。將所得復合物室溫靜置孵育1 h。按照DNase說明書進行操作，取5μL NH2-Gly/pEGFP或pEGFP溶液進行酶處理1 h，處理結束后將溶液低速離心，吸取底部溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，對照組為未使用DNase處理的pEGFP。

1.3.7 NH2-Gly/pEGFP的細胞相容性評價 采用MTT法對NH2-Gly及NH2-Gly/pEGFP的細胞毒性進行評價。將培養好的NIH 3T3細胞稀釋至一定倍數，按每孔1×104個細胞取100μL接種于96孔板中，放入37℃培養箱中培養24 h使細胞貼壁。細胞貼壁后吸去舊培養基，加入100μL培養基。向96孔板中分別加入不同質量濃度的NH2-Gly、NH2-Gly/pEGFP及PEI，然后將96孔板放入37℃培養箱中培養24 h或48 h后吸出培養基，加入0.5 mg/mL MTT的培養基溶液，放入37℃培養箱培養4 h。接著吸出MTT的培養基溶液，每孔加入100μL DMSO，于37℃搖床上以100 r/min避光振搖10 min，用酶標儀檢測490 nm處的吸光度。根據公式（3）計算細胞活力：

式中：A0為聚合物在加入MTT反應后形成溶液的吸光度；A1為陰性對照溶液的吸光度；A2為陽性對照溶液的吸光度。

1.3.8 NH2-Gly/pEGFP體外轉染效率 將培養狀態良好的NIH 3T3細胞稀釋一定倍數，向12孔板及共聚焦小皿中接種1 mL，密度為每孔1×105個細胞，放入37℃培養箱中培養24 h使細胞貼壁。分別制備不同質量比的NH2-Gly/pEGFP復合物和PEI/pEGFP復合物，向12孔板的每個孔中加入50μL復合物，補加無血清DMEM培養基使每個孔體積達到300μL。放入37℃培養箱中培養，孵育4 h，轉染完畢更換新鮮的含體積分數10%FBS的培養基，再繼續培養12、24、48 h。然后處理樣品，用PBS洗滌3次，再用胰酶消化，以1 000 r/min離心收集細胞，加入PBS重懸，用流式細胞儀測定轉染效率。用PBS沖洗2~3次，隨后將每個培養皿加入500μL質量分數4%的多聚甲醛固定液固定10 min，再用PBS沖洗2~3次后保存于500μL PBS中，采用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞轉染效果。

1.3.9 統計學處理 統計學處理計數資料以平均值±標準差表示，運用SPSS 23.0進行t檢驗或方差分析。

2 結果與討論

2.1 NH2-Gly的合成與表征

采用紅外光譜分析不同氨基化程度的NH2-Gly結構。由圖1可知，制備的NH2-Gly在1 699 cm-1處的強吸收峰不同于糖原，是酰胺的特征吸收峰，可以歸結為—C=O伸縮振動。此外，1 457~1 532 cm-1和1 263~1 291 cm-1處的吸收峰分別為—NH—彎曲振動和C—N振動[6]。此外，NH2-Gly在1 457~1 532 cm-1處的吸收峰較糖原明顯加強，且隨著氨基化程度的提高而增強。這些結果表明，糖原已成功被二乙烯三胺寡氨殘基修飾，得到了不同氨基化程度的NH2-Gly。

圖1 氨基化糖原紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of glycogen and NH2-Gly

粒徑和所帶電位很大程度上影響著基因載體的轉染效率。采用動態光散射粒度儀測定了NH2-Gly的粒徑和表面電位，結果見表1。所制備的NH2-Gly的水化粒徑范圍為50~90 nm。通過酸堿滴定可計算出不同物料比條件下制備的NH2-Gly的氨基取代度。由表1數據可知，氨基取代度隨活化劑CDI與糖原質量比的增加而增加。反應物料質量比為2∶5∶5所合成的NH2-Gly的氨基取代度最高，可達到42.6%。同時，在此條件下得到的NH2-Gly電位最高，達37.1 mV。據此可判斷物料質量比為2∶5∶5是合成NH2-Gly的較優條件。后續實驗中所用到的NH2-Gly均在此質量比下合成。帶有強正電荷的NH2-Gly具有較好的對目的基因進行壓縮包裹的能力。圖2為糖原和NH2-Gly的透射電鏡圖，可以看出，糖原和NH2-Gly為球形納米粒子結構，粒徑均在50 nm左右，且粒子分散均勻，幾乎無團聚現象。

圖2 透射電子顯微鏡圖Fig.2 Transmission electron microscopy images

表1 糖原和氨基化糖原的粒徑、電位、取代度Table 1 Size，zeta potential and degree of substitution of NH2-Gly

2.2 NH2-Gly的pH緩沖能力

陽離子聚合物的基因轉染能力與其緩沖能力密切相關。PEI具有“質子海綿”效應，表現出較高的緩沖能力。PEI所具有的“質子海綿”效應能夠使內吞小泡溶脹破裂，幫助PEI/基因復合物逃逸到細胞質中，從而具有較高的基因轉染能力。不同氨基化程度的NH2-Gly在NaCl水溶液中的緩沖能力見圖3。未修飾的糖原在pH突變時消耗HCl（0.1 mol/L）體積最少，緩沖性能較差，這是由于糖原自身游離的可供反應的基團較少所致。糖原被二乙烯三胺寡氨殘基修飾后，pH突變時消耗HCl體積有所增加，緩沖性能得到明顯改善。然而，由于NH2-Gly存在相對較少的氨基，其緩沖能力仍低于PEI 25k。隨著NH2-Gly的氨基取代度提高，溶液的酸堿緩沖能力顯著增強。NH2-Gly有望實現目的基因的有效轉染。

圖3 氨基化糖原和PEI 25k的pH緩沖能力Fig.3 Buffering capacity of NH2-Gly and PEI 25 k

2.3 NH2-Gly的血液相容性評價

將不同質量濃度的NH2-Gly與分離出的紅細胞一起孵育后，通過觀察不同質量濃度的NH2-Gly的溶血現象，評估NH2-Gly的血液相容性。如圖4所示，在NH2-Gly質量濃度高達200μg/mL時，NH2-Gly的溶血率遠遠低于陽性對照組的溶血率，未達到陽性對照組的5%。結果表明，NH2-Gly不會對紅細胞造成溶脹，NH2-Gly具有較好的血液相容性。

圖4 氨基化糖原的溶血活性評價Fig.4 Hemolysis activity of NH2-Gly

2.4 NH2-Gly對pEGFP的壓縮包載

載體能否對基因進行有效壓縮包裹是實現基因遞送的首要條件。采用瓊脂糖凝膠電泳考察NH2-Gly對目的基因pEGFP的壓縮包裹能力。圖5為不同質量比的NH2-Gly/pEGFP復合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。隨著NH2-Gly/pEGFP復合物質量比的升高，電場作用下遷移的pEGFP越來越少。當NH2-Gly與pEGFP質量比為2∶1時，泳道中已觀察不到遷移的pEGFP，pEGFP完全滯留在上樣孔內，表明此時NH2-Gly可完全壓縮包載pEGFP。NH2-Gly帶有較強的正電荷，隨著NH2-Gly與pEGFP質量比的增加，NH2-Gly與pEGFP之間的靜電相互作用得到增強。此結果表明，該NH2-Gly對pEGFP具有較好的壓縮包載能力，有望作為新型基因載體。

圖5 pEGFP和不同質量比NH2-Gly/pEGFP復合物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis analysis of the pEGFP and NH2-Gly/pEGFP complex with different weight ratios

2.5 NH2-Gly/pEGFP復合物的表征

載體/基因復合物的粒徑和電位是影響其轉染效率的重要因素。研究表明，適度的正電荷和合適的粒徑（50～200 nm）有利于載體/基因復合物的細胞攝取和胞內運輸[19-20]。NH2-Gly帶有較強的正電荷，可與pEGFP通過靜電作用組裝成納米粒子。表2為不同制備條件下得到的NH2-Gly/pEGFP復合物的粒徑與電位。當NH2-Gly與pEGFP質量比為1∶1時，復合物粒徑約為100 nm，電位為負值，說明此條件下NH2-Gly未能將pEGFP完全包載。這個結果與圖5中凝膠電泳結果一致。隨著NH2-Gly比例的增加，NH2-Gly/pEGFP復合物粒徑有所增大并保持相對穩定，多分散系數（PDI）在0.2左右，表明復合物粒徑比較均一。同時，NH2-Gly/pEGFP復合物所帶電荷也由負變正并保持穩定。以上結果表明，NH2-Gly/pEGFP復合物的粒徑和電位有利于細胞轉染。

表2 NH2-Gly/pEGFP的粒徑和電位Table 2 Size and zeta potential of NH2-Gly/pEGFP complex

2.6 NH2-Gly/pEGFP抗核酸酶降解能力

基因在遞送過程中易被血清中的核酸酶降解，導致基因治療的失敗。為了驗證NH2-Gly對pEGFP的保護能力，將NH2-Gly/pEGFP復合物以及pEGFP與DNase共孵育，然后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗。如圖6所示，NH2-Gly/pEGFP復合物的條帶清晰，表明其可以保護pEGFP免受核酸酶降解，而游離EGFP已經被DNase降解，無法看到條帶。此結果說明NH2-Gly對pEGFP的高效包載提高了pEGFP在血清中的穩定性，是一個優良的基因載體。

圖6 pEGFP和NH2-Gly/pEGFP復合物的穩定性Fig.6 Stability of the pEGFP and NH2-Gly/pEGFP complex

2.7 NH2-Gly/pEGFP的細胞毒性

陽離子基因載體的細胞毒性是影響其臨床應用的主要障礙之一。選擇PEI 25k作為對照，采用MTT法檢測了NH2-Gly和NH2-Gly/pEGFP對于NIH 3T3細胞的毒性。如圖7所示，培養24 h和48 h后，PEI和PEI/pEGFP在較低質量濃度下就已顯現出高細胞毒性，細胞存活率低于50%。這主要是由PEI 25k所具有的較高的正電荷密度以及骨架的不可降解性所導致。相反，NH2-Gly沒有抑制NIH 3T3的增殖，表現出良好的生物相容性。這主要歸因于糖原較好的生物相容性、生物可降解性以及NH2-Gly相對較低的電荷密度。NH2-Gly/pEGFP與細胞培養48 h后沒有表現出明顯毒性現象，質量濃度為30μg/mL時相對細胞存活率為108%，50μg/mL時相對細胞存活率為100%，100μg/mL時存活率仍超過90%。因此，NH2-Gly細胞毒性較低，具有較好的安全性，有望作為新型基因載體。

圖7 NH2-Gly和NH2-Gly/pEGFP對NIH 3T3細胞的毒性Fig.7 Cytotoxicity of NH2-Gly and NH2-Gly/pEGFP complex to NIH 3T3 cells

2.8 NH2-Gly/pEGFP體外轉染效率

基因復合物能否被細胞攝取很大程度上影響著基因治療的效果。首先利用共聚焦顯微鏡觀察了NH2-Gly/pEGFP在NIH 3T3細胞內的轉染情況。如圖8所示，轉染48 h后，NIH 3T3細胞的細胞質和細胞核中均可見表達的GFP的綠色熒光，且GFP熒光強度隨著NH2-Gly與pEGFP質量比的增加而增加，說明NH2-Gly/pEGFP在NIH 3T3細胞中的轉染效果明顯。其中，質量比10∶1時，復合物轉染的NIH 3T3細胞的GFP熒光強度最強，細胞形態正常且生長狀態好。NH2-Gly的轉染效果與PEI 25k相當。而PEI/pEGFP復合物轉染的細胞生長狀態欠佳，細胞少而分散且形態呈圓形，細胞生長狀態較差，綠色熒光較暗。質量比為10∶1的復合物獲得高轉染效率的原因主要有以下兩個方面：首先，NH2-Gly/pEGFP復合物細胞毒性小，高質量比易獲得高轉染效率，而PEI 25k的細胞毒性較大，提高轉染比例后細胞易死亡，從而引起轉染效率降低；其次，糖原可以被α-D-葡萄糖苷酶從非還原性末端降解，有利于DNA的釋放，可以提高轉染效率。

圖8 NH2-Gly/pEGFP在成纖維細胞中的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.8 Confocal laser scanning microscopy images of the transfection of NH2-Gly/pEGFP in NIH 3T3 cells

隨后用流式細胞儀定量考察了NH2-Gly/pEGFP及PEI/pEGFP復合物在NIH 3T3細胞中的轉染效果。由圖9可知，在24 h時，NH2-Gly與pEGFP質量比為5∶1的復合物轉染效率要明顯高于PEI/pEGFP復合物，說明其具有較快的轉染效率。這主要因為NH2-Gly/pEGFP具有較好的生物相容性。轉染48 h后，NH2-Gly與pEGFP質量比為10∶1的復合物轉染效果與PEI/pEGFP復合物的轉染效果相當。綜上所述，NH2-Gly載體具有較好的細胞轉染能力，其轉染效果可接近或超過PEI。考慮到NH2-Gly載體良好的生物相容性，NH2-Gly有望作為載體用于基因治療。

圖9 NH2-Gly/pEGFP復合物在NIH 3T3中的流式分析圖Fig.9 Flow cytometer of NH2-Gly/pEGFP complex in NIH 3T3 cells

3 結語

通過較為簡便的方法合成了氨基化的糖原衍生物（NH2-Gly）。NH2-Gly表面帶有較高的正電荷，同時具有良好的生物相容性和較好的緩沖能力。NH2-Gly可有效絡合pEGFP并保護其免受核酸酶的降解。NH2-Gly大幅提高了pEGFP在NIH 3T3細胞中的轉染效率，其轉染效率幾乎與PEI 25k相當。同時，與PEI相比，NH2-Gly的生物相容性更好。此外，溶酶體內含有大量的能夠分解糖原的α-葡萄糖苷酶，NH2-Gly/基因復合物有望在溶酶體內被α-葡萄糖苷酶水解，釋放出所包載的基因。同時，基于糖原易于功能化修飾的特點，未來還可以在NH2-Gly表面進一步修飾靶向基團，實現基因的靶向遞送。綜上，糖原有望作為安全高效的基因載體，在基因治療領域具有廣泛的應用前景。