1例Gitelman綜合征合并亞臨床甲狀腺功能減退癥患者SLC12A3基因突變位點鑒定及遺傳分析

李敏，黃穩瑩 ，張甜，郭英

1 濰坊醫學院附屬醫院內分泌代謝病科，山東濰坊 261000；2 濰坊醫學院

Gitelman 綜合征（GS）又稱家族性低鉀低鎂血癥，是一種罕見的常染色體隱性失鹽性腎小管疾病，發病率為1～10/40 000，多于青春期或成年期發病［1］。GS 主要臨床特征是低鉀血癥、代謝性堿中毒、低鎂血癥、低鈣尿癥，常累及骨關節、腎臟、心血管、消化和神經系統［2］。GS 有遺傳異質性，由SLC12A3 基因突變引起，目前已知的SLC12A3 基因突變超過500 個，該基因編碼腎臟遠曲小管噻嗪類利尿劑敏感的鈉氯共轉運蛋白（NCC），GS 診斷金標準是基因檢測［3］。研究［4-5］表明，甲狀腺激素水平會影響腎臟的生理和發育，慢性腎病和腎小球腎炎等腎臟疾病與甲狀腺功能異常密切相關，包括甲狀腺激素水平降低和橋本甲狀腺炎。GS 合并甲狀腺疾病的報道在國內外較少，臨床表現缺乏特異性，起病隱匿，易漏診和誤診。本研究對1 例GS 合并亞臨床甲狀腺功能減退癥患者及家庭成員進行了全基因組測序分析，以鑒別出GS 合并亞臨床甲狀腺功能減退癥的致病基因突變位點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者女，36 歲，因“間斷性全身乏力伴四肢麻木 1 年，加重 20 天”于 2021 年 7 月 30 日入院。1 年前患者無明顯誘因出現全身乏力伴四肢麻木，呈間斷性發作，每年發作5～6 次，未診治。20 d 前患者上述癥狀較前加重，伴憋氣，于當地醫院查血鉀2.2 mmol/L（正常范圍3.5～5.3 mmol/L），補鉀治療后癥狀緩解，復查血鉀3.9 mmol/L，患者自行停藥。入院前1 周患者再次出現上述癥狀，查血鉀2.9 mmol/L，補鉀后癥狀未改善，遂就診于本院。患者既往體健，否認高血壓病史，無重金屬、甘草類制劑、抗精神類藥、利尿劑等毒物和藥物接觸史。體格檢查：體溫 36.2 ℃，脈搏 90 次/min，呼吸 19次/min，血壓 108/66 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），體質量 63 kg，身高 167 cm，BMI 22.5 kg/m2。神志清、精神可，發育正常，營養中等，大小便正常。無突眼及滿月臉，甲狀腺無腫大。四肢肌力正常、肌張力低。心肺腹未見異常。入院后生化檢測結果示血鉀2.74 mmol/L，血鎂 0.63 mmol/L（正常范圍 0.7～1.1 mmol/L），血鈣2.38 mmol/L（正常范圍2.04～2.71 mmol/L），尿鉀84.6 mmol/24 h（正常范圍25～100 mmol/24 h），尿鈣 0.59 mmol/24 h（正常范圍2.5～7.5 mmol/L），立位腎素318.1 mIU/L（正常范圍4.4～46.1 mIU/L），臥位腎素117.2 mIU/L（正常范圍2.8～39.9 mIU/L），提示患者存在低血鉀、低血鎂、低尿鈣、腎素水平增加。腎上腺CT：左側腎上腺內側肢略增粗。胸部CT：右肺纖維結節。心臟超聲示：心包積液（微量）。其余垂體—腎上腺軸、性腺軸生化檢查、心電圖均正常。患者的弟弟35歲，自訴從15歲起活動后出現四肢無力、肌肉痙攣，胸悶憋氣癥狀，血液生化檢測曾發現血鉀低，血壓偏低（具體不詳），嗜鹽，未進行系統治療；患者之父患高血壓病，患者之母患甲狀腺功能亢進癥，均無GS 的臨床表現。

患者血液生化檢測結果：游離甲狀腺素（FT4）19.94 pmol/L（正常范圍11.97～21.88 pmol/L），游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）5.17 pmol/L（正常范圍3.1～6.8 pmol/L），促甲狀腺激素（TSH）4.97 μIU/L（正常范圍0.27～4.2 μIU/mL），促甲狀腺受體抗體（TRAb）＜0.8 IU/L（正常范圍0～1.75 IU/L），抗甲狀腺球蛋白抗體（Anti-TG）13.4 IU/mL（正常范圍0～115 U/mL），抗甲狀腺過氧化物酶抗體（Anti-TPO）10 IU/mL（正常范圍0～34 IU/mL），提示患者存在亞臨床甲狀腺功能減退癥。患者之母患甲狀腺功能亢進癥。在取得家庭成員同意的前提下，采集家庭成員外周血2 mL（EDTA 抗凝），進行致病突變基因位點鑒定。

1.2 GS致病突變基因位點鑒定 在患者及家屬同意的前提下進行全外顯子組測序檢測，抽取患者及父母、弟弟外周血2 mL（EDTA 抗凝血）提取基因組DNA。對基因組DNA 采用IDT The xGen Exome Research Panel v2.0 全外顯子捕獲芯片，捕獲與GS 相關基因的全部編碼區序列，進行突變篩查。根據患者突變篩查結果及臨床信息，通過OMIM 數據庫，MedGen、致病突變數據庫、正常人基因組數據庫、遺傳病數據庫等篩選所有與疾病相關的突變基因，根據美國醫學遺傳學和基因組學會（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）對該變異分級解讀，篩選等級為致病性的突變位點。對篩選的突變基因位點所在區域進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，經 ABI3730 測序儀進行 Sanger 測序驗證，并經序列分析軟件得到驗證結果。

2 結果

患者及弟弟SLC12A3 基因存在復合雜合突變c. 1964G＞A 及 c. 1456G＞A，分別導致 cDNA 第 1964位核苷酸鳥嘌呤（G）突變為腺嘌呤（A），cDNA 第1456 位核苷酸鳥嘌呤（G）突變為腺嘌呤（A），根據ACMG 指南，c. 1964G＞A 、c. 1456G＞A 均為致病突變，診斷為GS。表型正常家系成員檢測到1 處雜合突變，母親攜帶c. 1456 G＞A 雜合變異，父親攜帶c.1964 G＞A 雜合變異，均無GS臨床表現，為基因突變攜帶者。家系驗證結果（見圖1）顯示患者及弟弟的突變分別來自于其父母，為雜合突變，符合常染色體隱性遺傳。

圖1 SLC12A3基因c.1964G＞A，c.1456G＞A變異位點Sanger測序結果

3 討論

GITELMAN 等［6］在 1966 年首次報道了，GS 臨床癥狀主要是低血鉀、低血鎂在全身多系統的表現，有疲乏、肌無力、心悸、夜尿增多等，GS 通常合并糖代謝異常、生長發育與骨關節改變、腎小管疾病等慢性并發癥，最常合并甲狀腺疾病，機制尚不明確［7］。治療方法主要是鉀、鎂替代［2］。GS 發病機制為SLC12A3 基因突變導致的 NCC 缺陷［8］。SLC12A3 基因定位于染色體16q13，長約55 kb，含有26 個外顯子。目前已發現586 個SLC12A3 基因突變位點，研究發現 T60M、D486N、R913Q 和 R928C 突變在中國最為常見。突變類型包括錯義變異、剪切位點變異、無義變異和移碼變異，錯義變異在GS 中最常見［9］。大多數的GS 患者為復合雜合突變，純合突變、3 個及 3 個以上的突變也有報道［10］。SLC12A3 基因編碼的NCC 是含有1 021 個氨基酸的多肽，有12 個跨膜結構域。NCC 缺陷影響鈉和氯在腎遠曲小管重吸收：鈉重吸收減少，導致Na+/H+交換及Na+/K+交換代償性增加，引起低鉀血癥、代謝性堿中毒。氯再吸收減少導致遠曲小管膜超極化，進而電壓門控頂端膜鈣通道開放，鈣再吸收增加，引起低鈣尿癥［11］。JIANG 等［12］推測基因突變不僅影響 NCC，也通過下調瞬時受體電位陽離子通道6（TRPM6）引起低鎂血癥。GS 的診斷金標準是基因檢測。

本例患者的血液生化檢測示FT3、FT4 水平正常，TSH 水平升高，診斷為亞臨床甲狀腺功能減退癥，母親“甲狀腺功能亢進癥”病史多年，弟弟未行甲狀腺功能檢測。經Sanger 測序發現患者、弟弟及母親SLC12A3 基因均存在突變位點c.1456G＞A（p.Asp 486 Asn），患者及弟弟發病，攜帶同一基因突變的母親無GS 陽性體征，行家系遺傳篩查，患者及弟弟c.1456G＞A 的突變來源于母親，故推測SCL12A3基因中c.1456 G＞A 突變與甲狀腺功能相關。閱讀文獻發現c.1456 G＞A 突變與甲狀腺疾病相關性研究報道僅有 1 例。2018 年 LIU 等［13］對 1 例 16 歲男性GS 伴Graves 病（GD）的患者及其三代內的家庭成員進行SLC12A3 基因的遺傳分析，發現該名男性患者及其妹妹、父親、叔父、表姐SLC12A3 基因存在c.1456G＞A 突變位點，均合并不同程度的甲狀腺疾病（包括TSH 水平升高或甲狀腺自身抗體升高），有兩個突變位點的家系成員患有更嚴重的甲狀腺功能疾病；其外公及母親SLC12A3 基因攜帶（c. 2102-2107delACAAGA）基因突變，未見甲狀腺功能異常。在本研究中，SLC12A3 基因攜帶 c.1456 G＞A 突變的患者及母親均有甲狀腺疾病，患者弟弟未行甲狀腺功能檢測，父親SLC12A3 基因攜帶c.1964G＞A 突變無甲狀腺功能異常，故推測c.1456G＞A 突變與甲狀腺功能異常相關，但還需進一步進行探究。

通過閱讀文獻發現，血清鎂和甲狀腺激素水平密切相關：鎂通過激活磷脂酶C-γ1 參與了T 淋巴細胞的活化［14］，而自身免疫性甲狀腺疾病的發生與T淋巴細胞相關；鎂還參與了ATP 的合成，而碘的轉運依賴ATP 提供能量，所以鎂可以通過影響碘的轉運引起甲狀腺激素水平的變化［15］。有關鎂與甲狀腺功能的報道并不少見，MONCAYO 等［15］指出補充鎂可以改善甲狀腺的形態和功能。CHANDRA 等［16］長期用硫酸鎂喂養小鼠后，發現小鼠TSH 隨著硫酸鎂劑量的增大而升高。KRAVCHENKO 等［17］研究發現，甲狀腺腫的患者血清鎂的濃度較正常人群低。在本研究中，不排除低鎂血癥與甲狀腺功能存在一定的相關性。

研究［18］表明，甲狀腺疾病患者會出現疲乏、肌無力、胸悶憋氣等與GS類似的臨床癥狀，當GS患者合并甲狀腺疾病時，上述癥狀可能會加劇，需通過實驗室檢查、基因檢測明確。

GS 是一種遺傳性腎小管疾病，SCL12A3 基因突變為主要致病原因，確診該病的關鍵是基因檢測。我們通過全外顯子組測序對一個常染色體隱性遺傳的GS 家系進行致病突變分析，發現該家系2 個患者是由SLC12A3 基因c.1964G＞A，c.1456G＞A 錯義突變導致的。SLC12A3 基因第16 號外顯子的一個錯義突變 c. 1964G＞A（p. Arg 655 His），導致 cDNA 第1964 位核苷酸鳥嘌呤突變為腺嘌呤，該突變導致第655 位編碼的氨基酸由精氨酸（Arg）突變為組氨酸（His）；SLC12A3 基因第 12 號外顯子的一個錯義突變c.1456G＞A（p.Asp 486 Asn），導致cDNA 第1456位核苷酸鳥嘌呤突變為腺嘌呤，該突變導致第486位編碼的氨基酸由天冬氨酸（Asp）突變為天冬酰胺（Asn）。該復合雜合突變導致NCC 缺陷，蛋白質功能缺失。

總之，導致該患者發病的致病基因為SLC12A3基因，突變位點為 c. 1964 G＞A（p. Arg655His）、c. 1456G＞A（p. Asp486Asn）；c. 1964G＞A 位點的基因突變可能與甲狀腺功能相關，還需要進一步的基礎研究來闡明GS突變與甲狀腺功能之間的關聯。