A型塞尼卡病毒檢測(cè)方法及疫苗研究進(jìn)展

王遷遷，于永樂(lè)，李月華，董雅琴，尼 博，劉拂曉

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，青島 266109;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018;3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032)

A型塞尼卡病毒(SenecavirusA，SVA)也稱為塞尼卡谷病毒(SenecaValleyvirus，SVV)，屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)塞尼卡病毒屬(Senecavirus)，是該屬的唯一成員，且只有1個(gè)血清型[1]。2002年，研究人員偶然從人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞PER-C6培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)該病毒，最初認(rèn)為是一種細(xì)胞培養(yǎng)液中的污染物[2]。自1988年以來(lái)，SVA一直在美國(guó)的豬群中隱性傳播，直到2007年在加拿大首次發(fā)現(xiàn)了SVA感染病例[3]。隨后，在中國(guó)、泰國(guó)、越南、哥倫比亞等多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道了SVA感染[4-6]。2015年，中國(guó)廣東省豬場(chǎng)發(fā)現(xiàn)了SVA感染的病例[7]，之后SVA逐漸蔓延到福建、河北等其他省份[7-10]。據(jù)報(bào)道，至2019年12月，中國(guó)有超過(guò)一半的省、自治區(qū)和直轄市豬群感染SVA[11]。SVA引起豬的水泡病在臨床上與口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)、豬水泡病病毒(Swine vesicular disease virus，SVDV)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)等引起的癥狀難以區(qū)分。研究證實(shí)，該病毒可在豬群中垂直傳播[12]，且在小鼠和家蠅樣本中檢測(cè)到SVA，并從小鼠糞便和小腸中分離到活病毒，表明小鼠和家蠅可能對(duì)SVA的流行有潛在的作用[13]。除此之外，亞臨床感染病例的增加，SVA RNA持續(xù)存在于感染恢復(fù)期豬的扁桃體中，皆表明豬會(huì)長(zhǎng)期帶毒，使該病難以控制和消除。因此，開(kāi)發(fā)快速、靈敏的檢測(cè)方法及研制安全有效的疫苗對(duì)防控SVA傳播至關(guān)重要。筆者就近年來(lái)SVA檢測(cè)方法和疫苗研究進(jìn)行綜述，旨在提供有效信息以提高對(duì)SVA的綜合防控能力。

1 病毒分離和組織學(xué)檢測(cè)

1.1 SVA分離鑒定

病毒分離是檢測(cè)病毒最可靠的方法，可用于分離培養(yǎng)SVA的細(xì)胞系有多種，包括人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞PER-C6[14]、小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H446[15]、人肺癌細(xì)胞NCI-H1299[16-17]、人胚胎腎細(xì)胞HEK293T[18]、豬睪丸細(xì)胞(ST)[19]、乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21[20]和BSR-T7/5[21]、豬腎細(xì)胞PK-15[22]和IBRS2[8]。SVA感染后導(dǎo)致這些細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)。在BSR細(xì)胞單層上可觀察到SVA感染后細(xì)胞皺縮、裂解和從細(xì)胞瓶底部脫落等典型的CPE[23]。病毒分離鑒定被認(rèn)為是傳染病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但這種方法耗時(shí)長(zhǎng)，且不一定能分離成功。

1.2 免疫組化和原位雜交技術(shù)

基于組織學(xué)診斷是確定病原體潛在作用的最重要方法之一。免疫組化(IHC)和原位雜交(ISH)可用于鑒定病原體的存在及其與組織內(nèi)形態(tài)學(xué)變化的關(guān)系，進(jìn)一步確定病原體是否是疾病的致病因素。免疫組化識(shí)別與病原體相關(guān)的特定蛋白質(zhì)，而原位雜交則檢測(cè)組織切片中的病原體核酸。

1.2.1 免疫組化 免疫組化可用于檢測(cè)組織樣本中的病原體，Leme等[6]通過(guò)SVA單克隆抗體進(jìn)行的免疫組化顯示，新生仔豬易被SVA感染，由于病毒對(duì)多種組織的嗜性而導(dǎo)致多系統(tǒng)疾病。Oliveira等[24]利用免疫組化標(biāo)記物將自然感染SVV的哺乳仔豬的淋巴變化聯(lián)系起來(lái)發(fā)現(xiàn)，SVV可在仔豬體內(nèi)復(fù)制和誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，首次證明SVV與哺乳仔豬淋巴組織之間的關(guān)系。雖然免疫組化可檢測(cè)與組織病變相關(guān)的抗原，但其需特異性的抗體，這些抗體并不易獲得，而原位雜交技術(shù)克服了這一限制。

1.2.2 原位雜交技術(shù) RNA原位雜交技術(shù)可通過(guò)cRNA或寡核苷酸等探針檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)RNA的表達(dá)，已用于檢測(cè)不同組織中的SVA抗原。該技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)聯(lián)合使用可從感染SVA動(dòng)物的扁桃體中檢測(cè)到SVA RNA的存在[17]。Resende等[25]開(kāi)發(fā)了一種新型原位雜交技術(shù)——RNAscope來(lái)檢測(cè)感染組織中的SVA RNA，這種新型原位雜交技術(shù)建立了組織學(xué)病變與病毒之間的聯(lián)系，背景和非特異性染色較少，極大地消除了經(jīng)典原位雜交技術(shù)中的假陽(yáng)性染色。與免疫組化相比，原位雜交技術(shù)能通過(guò)靶向特定信使RNA檢查組織學(xué)病變中特定病原體的存在，有助于在缺乏免疫組化商業(yè)抗體的情況下診斷新出現(xiàn)的病原體。

2 血清學(xué)診斷方法

現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出多種檢測(cè)抗SVA抗體的檢測(cè)方法，包括間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、均相光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)和病毒中和試驗(yàn)。ELISA方法因其操作簡(jiǎn)單、快速靈敏，是血清學(xué)診斷中常用的技術(shù)手段，其他新興技術(shù)的開(kāi)發(fā)也為快速檢測(cè)SVA提供了可靠的血清學(xué)方法。

2.1 間接ELISA

間接ELISA只需純化的抗原，因此不易發(fā)生改變單克隆抗體結(jié)合表位反應(yīng)性的突變。VP1、VP2和VP3構(gòu)成SVA的衣殼蛋白，具有較強(qiáng)的抗原性，可刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，是SVA主要的診斷靶抗原。

2.1.1 基于VP1的ELISA方法 小RNA病毒的VP1蛋白分布在病毒顆粒的最外部，具有最強(qiáng)的免疫原性，已用于許多ELISA試驗(yàn)檢測(cè)病毒抗體。抗SVA VP1蛋白抗體的測(cè)定可以作為檢測(cè)SVA感染細(xì)胞的方法[10]。目前，重組VP1蛋白及其多克隆抗體的成功制備為血清學(xué)檢測(cè)方法的建立提供了良好的生物材料[26]。已有研究者利用純化的重組VP1(rVP1)蛋白作為包被抗原建立了SVA VP1的間接ELISA抗體檢測(cè)方法，并用大量試驗(yàn)和臨床樣本對(duì)其進(jìn)行了評(píng)估，具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性[27-28]，通過(guò)此種方法可在SVA暴發(fā)的早期階段檢測(cè)到臨床感染和非臨床感染母豬的SVA血清轉(zhuǎn)化及仔豬的母源抗體[29]。

2.1.2 基于VP2的ELISA方法 VP2中存在許多單克隆抗原表位，其特異性IgM抗體反應(yīng)與SVA感染早期的中和抗體水平相關(guān)，比VP1蛋白更保守，更適用于血清學(xué)檢測(cè)[30-31]。因此，制備重組VP2蛋白及其多克隆抗體將有助于建立SVA特異性血清學(xué)診斷方法[32]。有研究報(bào)道，與VP1和VP3蛋白相比，SVA VP2蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法具有更高的特異性和靈敏度[33]，且利用VP2蛋白建立的ELISA方法與間接免疫熒光抗體方法的符合率為95.5%[34]，與血清中和抗體試驗(yàn)符合率為91.9%[35]。Maggioli等[36]研究發(fā)現(xiàn)，VP2和VP3蛋白可能含有SVA的主要中和表位，其特異性抗體反應(yīng)與SVA感染早期中和抗體水平相關(guān)。因此，開(kāi)發(fā)基于VP2和VP3蛋白的ELISA檢測(cè)方法有助于檢測(cè)抗原篩選[37]。

2.1.3 基于VP3的ELISA方法 SVA感染的急性期，機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要是抗VP2和VP3的特異性IgM；在康復(fù)期，機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要是VP1、VP2、VP3的特異性IgM和IgG[36]，說(shuō)明VP3蛋白在感染的早期就能產(chǎn)生中和抗體，可作為SVA早期檢測(cè)的靶標(biāo)抗體。有關(guān)VP3 ELISA方法的研究相對(duì)較少，國(guó)內(nèi)學(xué)者以VP3蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法敏感性略低于中和試驗(yàn)，但仍具有較高的敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，為不同蛋白所建立的間接ELISA方法的對(duì)比奠定了基礎(chǔ)[38]。

2.2 競(jìng)爭(zhēng)ELISA

血清中的特異性抗體水平是鑒別病毒感染的有效指標(biāo)。競(jìng)爭(zhēng)ELISA被廣泛用于血清抗體檢測(cè)，該檢測(cè)方法測(cè)定了臨床樣本中存在的抗體與特異性單克隆抗體之間對(duì)特定抗原的競(jìng)爭(zhēng)。Yang等[39]開(kāi)發(fā)了一種用于血清學(xué)診斷的特異性單克隆抗體，并用該抗體建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，然而，由于血清樣本數(shù)量有限，該檢測(cè)方法并未得到充分驗(yàn)證。2017年，Goolia等[19]利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)SVA陽(yáng)性豬血清樣本及多種來(lái)源的SVA陰性血清樣本進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)將競(jìng)爭(zhēng)ELISA與病毒中和試驗(yàn)和免疫熒光抗體試驗(yàn)進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，3種方法的結(jié)果具有很強(qiáng)的一致性。競(jìng)爭(zhēng)ELISA比其他檢測(cè)方法更具優(yōu)勢(shì)，其操作更快、更簡(jiǎn)單、成本更低，但其包被滅活病毒，需要培養(yǎng)大量純度較高的病毒，具有散毒的風(fēng)險(xiǎn)。而阻斷ELISA以SVA VP2蛋白作為抗原，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的針對(duì)VP2的單克隆抗體作為二抗，可減少試驗(yàn)過(guò)程中散毒的風(fēng)險(xiǎn)，利用該方法檢測(cè)豬血清中的SVA抗體，并與中和試驗(yàn)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的符合率為70.1%[40]和96.0%[41]。

2.3 均相光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)

均相光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)(AlphaLISA)是近幾年快速發(fā)展的新型檢測(cè)技術(shù)，也是目前利用高通量技術(shù)進(jìn)行樣品檢測(cè)的較好方法，已在生物研領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。該技術(shù)在動(dòng)物傳染病上的應(yīng)用較少，且目前只有國(guó)內(nèi)學(xué)者開(kāi)發(fā)了AlphaLISA血清學(xué)檢測(cè)方法，用于臨床上快速區(qū)分SVA和其他疾病，來(lái)監(jiān)測(cè)國(guó)內(nèi)SVA感染的流行趨勢(shì)[42]。與傳統(tǒng)ELISA方法相比，該方法具有節(jié)約血清樣本、簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟和縮短整體試驗(yàn)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的SVA血清學(xué)診斷試劑盒提供了新思路。目前該方法在檢測(cè)病原微生物方面尚處于初級(jí)階段，需進(jìn)行大量臨床樣本檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證該技術(shù)用于快速檢測(cè)SVA的可行性。

2.4 病毒中和試驗(yàn)

病毒中和試驗(yàn)廣泛用于評(píng)估血清中抗SVA的抗體，其對(duì)傳染病進(jìn)行回顧性和前瞻性血清學(xué)研究及概述動(dòng)物健康狀況非常重要，是確定傳染源進(jìn)入一個(gè)國(guó)家的時(shí)間及與感染相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素的重要工具。Saporiti等[43]利用該方法對(duì)2014年巴西暴發(fā)SVA感染疫情前后的大量血清樣本進(jìn)行了回顧性血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2014年之前，巴西主要生豬產(chǎn)區(qū)沒(méi)有出現(xiàn)SVA。基于CPE的病毒中和試驗(yàn)已被用于檢測(cè)針對(duì)SVA的中和抗體，野生型SVA引起的CPE在某些接毒孔中通常不太明顯，無(wú)法通過(guò)常規(guī)病毒中和試驗(yàn)確定正確的結(jié)果，而基于表達(dá)eGFP重組病毒的病毒中和試驗(yàn)比單獨(dú)使用野生型SVA的方法敏感性和特異性更高[21]。

3 病毒核酸檢測(cè)方法

病毒核酸檢測(cè)方法廣泛應(yīng)用于SVA RNA的檢測(cè)，主要有PCR和基因組測(cè)序技術(shù)，PCR技術(shù)是常用的病毒核酸檢測(cè)方法，通過(guò)PCR檢測(cè)SVA核酸，加快了對(duì)該病毒的臨床診斷，并幫助研究人員了解該病毒的發(fā)病機(jī)制。基因組測(cè)序技術(shù)可檢測(cè)未知的RNA病毒及識(shí)別和表征樣品中的整個(gè)微生物組，對(duì)鑒別新型病原體和研究特定RNA病毒的進(jìn)化機(jī)制至關(guān)重要。

3.1 普通PCR

普通PCR靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，不僅可用于實(shí)驗(yàn)室診斷，也適用于養(yǎng)殖場(chǎng)SVA的檢測(cè)。RT-PCR可作為一種可靠的病原檢測(cè)方法用于SVA的分子流行病學(xué)調(diào)查，范慧等[44]利用該技術(shù)對(duì)山東地區(qū)的豬水皰液、心臟、扁桃體等組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)SVA感染陽(yáng)性率處于較低水平。Leme等[4]利用RT-PCR方法首次在巴西豬群中檢測(cè)到SVA，這是第1份報(bào)告北美以外豬臨床感染SVA的研究。劉濤等[45]還報(bào)道了一種能同時(shí)檢測(cè)鑒別SVA和FMDV的雙重RT-PCR方法，為2種病毒的鑒別診斷提供了重要的工具。

3.2 巢式PCR

與普通RT-PCR技術(shù)相比，巢式PCR技術(shù)具有更高的靈敏性和反應(yīng)效率，操作簡(jiǎn)單。在普通RT-PCR中目標(biāo)傳染病病原體樣本呈陰性的情況下，以及當(dāng)其他技術(shù)不可用或需對(duì)大量樣本進(jìn)行病毒檢測(cè)時(shí)，此方法可用于流行病學(xué)研究中的病毒檢測(cè)及通過(guò)對(duì)被感染和未被感染豬群中的SVA進(jìn)行常規(guī)檢查來(lái)進(jìn)行健康監(jiān)測(cè)[46]。

3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、快速等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)中。實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要分為探針?lè)ê腿玖戏ǎ谔结樀臋z測(cè)方法具有更高的診斷特異性，適用于病毒感染早期檢測(cè)，因此通常是分子診斷的最佳選擇[47-48]。雖然染料法特異性比探針?lè)ㄉ圆睿涑杀据^低，更經(jīng)濟(jì)，且能有效避免試驗(yàn)過(guò)程污染、減少試驗(yàn)中存在的假陽(yáng)性[49]。國(guó)內(nèi)外研究人員目前已開(kāi)發(fā)了多種實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)來(lái)診斷SVA感染，且這些檢測(cè)方法的診斷靈敏度和特異性都已用試驗(yàn)和/或臨床樣本進(jìn)行了廣泛的評(píng)估。這些診斷方法引物的設(shè)計(jì)針對(duì)不同的保守區(qū)域，包括3D基因[50-52]、VP1基因[53-56]、5′-UTR[57]、L/VP4基因[58]等。由于SVA與FMDV感染豬群引起的臨床癥狀、病理變化非常相似，難以區(qū)分，需借助實(shí)驗(yàn)室分子診斷技術(shù)才能鑒別出來(lái)，因此一些有學(xué)者建立了FMDV和SVA的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法[59-60]及針對(duì)不同血清型的FMDV和SVA的多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法[61]，利用同一個(gè)反應(yīng)即可快速同時(shí)鑒別出SVA和FMDV，大大縮短了檢測(cè)周期。這些診斷工具可在水泡病暴發(fā)期間提供SVA的早期檢測(cè)，對(duì)控制和區(qū)分其他水泡病至關(guān)重要。

3.4 恒溫?zé)岣艚^式PCR(iiPCR)

iiPCR技術(shù)最早由Krishnan等[62]提出，是一種基于熱對(duì)流原理的全新熒光定量PCR技術(shù)，該檢測(cè)方法在一個(gè)便攜式機(jī)器中進(jìn)行，可進(jìn)行敏感和特異的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。Zhang等[57]開(kāi)發(fā)的基于3D基因的RT-iiPCR技術(shù)具有很高的敏感性，可檢測(cè)歷史和當(dāng)前SVA分離株，且評(píng)估了建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR與RT-iiPCR 2種方法對(duì)臨床樣本的診斷性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2種方法之間具有很高的一致性。

3.5 微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)

ddPCR是一種新興的核酸檢測(cè)技術(shù)，與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、PCR相比具有一些優(yōu)勢(shì)，不依賴校準(zhǔn)曲線，能對(duì)包括DNA和RNA在內(nèi)的核酸進(jìn)行絕對(duì)定量，已應(yīng)用于多種動(dòng)物和人類病毒。然而，有關(guān)該技術(shù)應(yīng)用于SVA的報(bào)道較少，目前這些方法的建立主要靶向SVA 3D基因，Zhang等[63]用臨床樣本對(duì)RT-ddPCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 2種方法的檢測(cè)性能進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，SVA RT-ddPCR比實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR靈敏度高約10倍，且一步法RT-ddPCR的檢測(cè)限和分析特異性優(yōu)于兩步法，這為SVA的檢測(cè)和絕對(duì)定量提供了一種新方法[64]。

3.6 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

3.6.1 重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RPA) RPA是近年來(lái)出現(xiàn)的恒溫、核酸快速擴(kuò)增技術(shù)，是一種相對(duì)較新的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、擴(kuò)增速度快及在低溫恒溫下操作等優(yōu)點(diǎn)，尤其是在缺乏支持PCR設(shè)施的環(huán)境中，這種新技術(shù)可實(shí)現(xiàn)及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)，已廣泛用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)的診斷研究。由于RPA可作為PCR有效的替代方法，因此可通過(guò)與其他平臺(tái)相結(jié)合來(lái)開(kāi)發(fā)靈敏度高和等溫效率高的RPA，包括瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、側(cè)流層析試紙條和熒光染料(定量)等。但目前只有國(guó)內(nèi)學(xué)者開(kāi)發(fā)了SVA實(shí)時(shí)熒光RPA[65]和重組酶聚合酶擴(kuò)增-側(cè)流層析試紙條(RPA-LFD)[66]檢測(cè)方法。盡管目前RPA在SVA檢測(cè)中的應(yīng)用研究很少，但由于其設(shè)備要求簡(jiǎn)單和反應(yīng)時(shí)間短，其在豬群感染SVA的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷方面具有較大的市場(chǎng)潛力。

3.6.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP) 基于LAMP檢測(cè)RNA病毒的方法需要在恒溫下孵育，無(wú)需復(fù)雜的儀器，被認(rèn)為是病毒病原體檢測(cè)和鑒定的替代方法。迄今為止，已開(kāi)發(fā)并評(píng)估了4種LAMP技術(shù)來(lái)診斷SVA。Armson等[67]用凍干試劑開(kāi)發(fā)了2種RT-LAMP，分別靶向5′-UTR和VP3-1區(qū)域，與Fowler等[51]開(kāi)發(fā)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR相比，這2種方法的檢測(cè)靈敏度均為100%，在12 min內(nèi)即可獲得結(jié)果。Zeng等[68]基于VP2區(qū)域開(kāi)發(fā)了RT-LAMP檢測(cè)方法，用118個(gè)現(xiàn)場(chǎng)樣本對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證，并與普通RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果顯示，該RT-LAMP表現(xiàn)出更高的靈敏度和效率。Li等[69]設(shè)計(jì)LAMP引物用于靶向SVA 3D基因序列的保守區(qū)域，將RT-LAMP與橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)(LFD)相結(jié)合，首次開(kāi)發(fā)了一種有利于SVA診斷的RT-LAMP-LFD檢測(cè)方法，并將該方法與普通RT-PCR對(duì)33份血清樣本進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果顯示，RT-LAMP-LFD方法比普通RT-PCR具有更高的臨床檢出率，可用于分析SVA感染的組織、囊泡和血清等臨床樣本。

3.7 基因組測(cè)序

病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)和PCR技術(shù)等方法需事先掌握待檢測(cè)病原體的信息。因此，當(dāng)檢測(cè)意外出現(xiàn)的病毒或早期階段的變異株時(shí)，在幾乎沒(méi)有相關(guān)信息的情況下，這些方法將不可避免地減慢病原體鑒定過(guò)程。多種基因組測(cè)序技術(shù)的開(kāi)發(fā)可及時(shí)發(fā)現(xiàn)新型的病原體，測(cè)序產(chǎn)生的基因組信息可用于支持其他診斷方法的開(kāi)發(fā)[10,70]。基因組測(cè)序技術(shù)非常便于調(diào)查病原體未知的傳染病暴發(fā)，Tan等[71]以SVA為模型，評(píng)估并比較了牛津納米孔(Oxford Nanopore)直接RNA測(cè)序(DRS)和傳統(tǒng)的擴(kuò)增測(cè)序(PCR-cDNA，PCS)對(duì)RNA病毒的快速檢測(cè)和基因組生成，PCS的一致性達(dá)到了99%，遠(yuǎn)高于DRS(94%)，PCS耗時(shí)長(zhǎng)，但可產(chǎn)生更準(zhǔn)確的一致性，適用于病毒拷貝數(shù)較高的樣本；DRS可直接對(duì)RNA鏈進(jìn)行測(cè)序，耗時(shí)短，允許檢測(cè)核酸堿基修飾。這2種測(cè)序方法都可用于檢測(cè)未知的RNA病毒病原體，且由于測(cè)序儀的便攜性使其更適用于現(xiàn)場(chǎng)診斷。二代測(cè)序可用于識(shí)別和表征樣品中的整個(gè)微生物組，Liu等[23]通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)對(duì)連續(xù)傳代的重組病毒進(jìn)行測(cè)序分析，揭示了SVA進(jìn)化的動(dòng)力學(xué)。

4 疫 苗

疫苗接種是預(yù)防和控制SVA最有效的方法。然而目前防控該病仍無(wú)商品化疫苗，大量的亞臨床感染增加了控制該病傳播的難度。因此，亟需開(kāi)發(fā)安全有效的SVA新型疫苗，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開(kāi)發(fā)了多種候選疫苗用于預(yù)防SVA感染。

4.1 弱毒疫苗

目前弱毒疫苗的開(kāi)發(fā)主要利用反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救重組的SVA毒株，SVA全長(zhǎng)cDNA感染性克隆的構(gòu)建有助于后續(xù)改良活病毒疫苗的開(kāi)發(fā)[72]。Sharma等[73]描述了一種利用反向遺傳學(xué)技術(shù)開(kāi)發(fā)的重組減毒SVA活疫苗(rSVAm SacⅡ)，用該活病毒和滅活的病毒制劑通過(guò)肌內(nèi)(IM)或鼻內(nèi)(IN)途徑免疫4周齡仔豬來(lái)評(píng)估rSVAm SacⅡ的免疫原性和保護(hù)效力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單劑rSVA mSacⅡ活病毒引起的抗SVA中和抗體(NA)水平顯著高于兩劑rSVA mSacⅡ滅活疫苗制劑，表現(xiàn)出對(duì)異源SVA毒株攻擊后的保護(hù)作用，因此該弱毒株可能是預(yù)防和控制豬SVA暴發(fā)的良好候選疫苗，但仍需更多的研究來(lái)評(píng)估這種病毒在免疫群中傳代的遺傳穩(wěn)定性。

4.2 滅活疫苗

滅活疫苗不含任何活性成份，與弱毒疫苗相比其安全性更高，誘發(fā)疾病的風(fēng)險(xiǎn)低。迄今為止，已分離出了多種SVA毒株，一些分離株滅活之后免疫豬表現(xiàn)出良好的免疫原性和保護(hù)效力，來(lái)自中國(guó)福建的SVA分離株CH-FJ-2017，是報(bào)道的第1個(gè)可用于控制SVA感染的候選疫苗株，Yang等[74]在豬中評(píng)估了該滅活疫苗的免疫原性，發(fā)現(xiàn)用2 μg疫苗制劑免疫的動(dòng)物產(chǎn)生了更高滴度的NA抗體，并保護(hù)豬免受同源SVA攻擊。 然而，免疫1/3或1/9疫苗劑量的動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生較低水平的NA抗體，且只能部分保護(hù)豬免受SVV感染。2018年從中國(guó)廣東分離的1株SVA毒株(GD-ZYY02-2018)滅活后也被證明對(duì)受同源病毒攻擊的育肥豬具有保護(hù)作用[75]。Li等[76]證實(shí)小鼠是初步評(píng)價(jià)SVA疫苗免疫原性和保護(hù)效果的候選動(dòng)物模型，利用該模型評(píng)估了2019年在河南分離的SVA毒株CH-HNCY-2019，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滅活的SVA CH-HNCY-2019疫苗具有免疫原性，可完全保護(hù)小鼠免受同源株攻擊。

4.3 核酸疫苗

核酸疫苗是基于克隆到遞送質(zhì)粒中的DNA或直接注射信使RNA，經(jīng)濟(jì)高效，內(nèi)源性蛋白質(zhì)的合成模擬了自然感染，因此，抗原以其天然形式呈遞，可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，沒(méi)有感染的風(fēng)險(xiǎn)。基于核酸疫苗的一些應(yīng)用潛力，魏婷等[77]構(gòu)建了含有SVA P12A-3C編碼序列的真核表達(dá)質(zhì)粒并在小鼠免疫中初步證實(shí)該表達(dá)質(zhì)粒能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生一定的免疫反應(yīng)，但該表達(dá)質(zhì)粒引起的免疫反應(yīng)較低，需進(jìn)一步優(yōu)化來(lái)提高核酸疫苗的免疫效力。

4.4 亞單位疫苗

亞單位疫苗通過(guò)將免疫原注入動(dòng)物體內(nèi)來(lái)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，與傳統(tǒng)疫苗相比其安全性好，不良反應(yīng)小。SVA VP1蛋白是具有較強(qiáng)免疫原性的結(jié)構(gòu)蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)，利用SVA VP1重組蛋白聯(lián)合佐劑免疫小鼠可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答且效果良好，SVA亞單位候選疫苗可能成為預(yù)防SVA傳播的有力工具[78]。表位的研究是當(dāng)前的熱點(diǎn)，鑒定出的抗原表位對(duì)設(shè)計(jì)SVA表位疫苗具有潛在的價(jià)值。目前，已成功鑒定出了多個(gè)線性B細(xì)胞抗原表位[79]和T細(xì)胞抗原表位[80]，這些T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原表位的成功鑒定有助于表位疫苗的研發(fā)和檢測(cè)方法的建立。病毒樣顆粒(VLPs)具有與天然病毒粒子相似的結(jié)構(gòu)特征，但不含病毒基因組，因而不具感染性，是目前基因工程疫苗研究的熱點(diǎn)。莫亞霞等[81]成功表達(dá)出具有良好反應(yīng)原性的SVA衣殼蛋白VP0、VP1和VP3，去除His-MUMO后還原天然構(gòu)象的目的蛋白可組裝成五聚體，為制備SVA VLPs奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。Mu等[82]、伍春平等[83]開(kāi)發(fā)的SVA VLPs疫苗在免疫動(dòng)物后能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的特異性中和抗體，為SVA的預(yù)防和消除提供了一種優(yōu)于滅活疫苗的候選疫苗。

5 小 結(jié)

SVA感染的臨床癥狀與其他重要的水泡性疾病(如口蹄疫)難以區(qū)分，可能導(dǎo)致破壞性的經(jīng)濟(jì)損失。因此，SVA感染的暴發(fā)可能會(huì)對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生重大影響。SVA的快速診斷對(duì)于識(shí)別病原體和鑒別臨床上難以區(qū)分的傳染病非常重要。目前已建立了適用于實(shí)驗(yàn)室、現(xiàn)場(chǎng)等多種檢測(cè)方法，但有關(guān)SVA疫苗的研究報(bào)道相對(duì)較少，且無(wú)商品化疫苗用于預(yù)防SVA感染。SVA自發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直在不斷地進(jìn)化，這可能導(dǎo)致病毒致病性增強(qiáng)及臨床病例不斷出現(xiàn)。SVA在受感染的豬群中可水平和垂直傳播，豬免疫力下降及病毒在動(dòng)物和環(huán)境中持續(xù)存在可能在豬群中引發(fā)新的暴發(fā)。目前，除了畜牧業(yè)生物安全體系外，尚無(wú)有效預(yù)防SVA感染的策略和方法，因此加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，包括環(huán)境中鼠、蒼蠅等傳播媒介的清除，減少飼養(yǎng)密度，提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力，同時(shí)加強(qiáng)在豬群中對(duì)SVA的主動(dòng)監(jiān)測(cè)，將能有效防控該病的大范圍暴發(fā)。