硫化氫對順鉑致犬腎臟氧化損傷及炎癥的緩解作用

王 爽，劉星堯，賈昊天，劉 云

(東北農業大學動物醫學學院，黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室，哈爾濱 150030)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種以腎功能迅速下降的臨床綜合征，同時AKI是住院患者最常見的并發癥之一，使患者死亡風險增加10～15倍[1]。研究表明，AKI的發病機制主要與腎臟組織炎癥反應、壞死和氧化應激損傷等有關[2-3]。順鉑是臨床上一種常見的抗腫瘤化學藥物，其代謝毒副作用能夠損傷腎小管細胞并誘導腎臟組織炎癥，最終導致AKI發生[4-5]。在獸醫臨床上，犬AKI發病急、發病快，且病犬更易在藥物代謝毒副作用下發展成為腎衰竭，嚴重時可導致病犬死亡。因此，探究預防和治療犬AKI的有效方法對獸醫臨床具有重要意義。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種無色、劇毒、酸性氣味的有害氣體，能夠引起機體多種器官發生損傷[6-7]。隨著研究的深入，人們發現動物體內存在H2S氣體分子[8]，它成為動物體內繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第3種氣體信號分子，在不同組織中發揮著重要的生理功能。內源性H2S具有很強的抗氧化作用，它能清除活性氧(ROS)，提高細胞內谷胱甘肽(GSH)的水平[9]。另外，H2S具有明顯的抗炎作用，能夠下調炎癥因子，如白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核轉錄因子-κB(NF-κB)等[10]。研究發現，給予結腸炎小鼠H2S可降低炎癥因子TNF-α的表達，而抑制小鼠體內H2S的合成易誘發小鼠結腸炎。硫氫化鈉(NaHS)是外源性H2S供體，外源給予NaHS能夠明顯改善大鼠氣道炎癥[11]。此外，近幾年有報道稱阿托伐他汀可通過提高內源性H2S緩解小鼠腎臟組織炎癥、細胞凋亡和過度的氧化應激，進而緩解AKI[12]。但H2S能否在犬AKI的防治中發揮抗氧化和抗炎作用還未可知。鑒于此，本試驗通過靜脈注射順鉑建立犬AKI模型，探究H2S對順鉑誘導的犬腎臟組織功能、抗氧化水平和炎癥因子等變化的影響，以期為緩解AKI提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

18只2～3歲、體重為8～12 kg的健康成年雄性比格犬飼養于清潔干燥、通風良好、室溫(20±2)℃的動物房中，自由進食和飲水。

1.2 主要試劑及儀器

注射用順鉑(凍干型)購自齊魯制藥有限公司；NaHS由東北農業大學動物醫學學院臨床外科教研室提供；肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、GSH、過氧化氫(H2O2)和NO試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Trizol購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒及SYBR Green熒光染料均購自寶日醫生物有限公司；HE染液購自武漢塞維爾生物科技有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、環氧合酶2(COX2)、誘導型一氧化物合酶(iNOS)、IL-4和IL-10抗體均購自萬類生物科技有限公司；GAPDH和辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG均購自北京博奧森生物技術有限公司。Epoch酶標儀(LD-96A)購自BioTek公司；體視顯微鏡(TE2000-U)購自Nikon公司；化學發光呈像儀(Tanon 5200)購自上海天能公司；熒光定量PCR儀(羅氏480)購自Roche公司。

1.3 試驗動物分組與處理

18只健康成年比格犬隨機分為對照組(C)、順鉑組(cis)和硫化氫+順鉑組(H+cis)3組，每組6只。對照組犬經頭靜脈注射生理鹽水；順鉑組犬經頭靜脈注射5 mg/kg順鉑[13]；硫化氫+順鉑組(H+cis)犬在注射順鉑前30 min，經頭靜脈注射1 mg/kg NaHS溶液，并且每隔24 h注射1次，共3次。

1.4 樣品采集與處理

注射順鉑72 h后對犬進行麻醉，靜脈采血，4 ℃放置2 h，3 500 r/min離心10 min后收集血清，-20 ℃保存備用。收集血液樣本后以外科方式無菌采集左側部分腎臟組織，用生理鹽水漂洗后，一部分腎臟組織固定于4%多聚甲醛，用于制備腎臟組織病理切片，剩余組織-80 ℃保存備用。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 生化指標檢測 使用生化試劑盒檢測血清中Scr和BUN含量，評價犬腎臟組織損傷程度。通過生化試劑盒檢測犬腎臟中GSH、H2O2和NO的含量，評價順鉑致犬腎臟氧化損傷的程度以及H2S對犬腎臟抗氧化能力的影響。所有操作均按照試劑盒說明書進行。

1.5.2 腎臟病理學檢測 將腎臟組織于4%多聚甲醛中固定24 h后，無水乙醇脫水，石蠟包埋并進行切片，脫蠟，HE常規染色，于顯微鏡下觀察腎臟組織的病理變化。

1.5.3 RNA的提取及實時熒光定量PCR 采用Trizol法提取各組腎臟總RNA。 按照反轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。 根據GenBank中犬IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、TNF-α、NF-κB、COX2、iNOS基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物信息見表1。引物均由廣州擎科生物有限公司合成。以GAPDH為內參，進行實時熒光定量PCR反應。PCR反應體系20 μL：RNA 2 μg，2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，RNase-free ddH2O補至20 μL。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環；95℃ 5 s，60 ℃ 1 min；50 ℃ 30 s。采用2-ΔΔCt法計算基因mRNA的相對表達量。

1.5.4 總蛋白提取和Western blotting 稱取1 g犬腎臟提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，PBS調節蛋白濃度一致，取400 μL蛋白樣品加入100 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水煮15 min，分裝后-80 ℃保存備用。取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE，轉印到PVDF膜上，用5%脫脂乳封閉1 h，一抗IL-1β(1∶1 000)、IL-6(1∶1 000)、TNF-α(1∶500)、NF-κB(1∶500)、COX2(1∶1 000)、iNOS (1∶500)、IL-4 (1∶500)、IL-10 (1∶500)及GAPDH (1∶50 000)于4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗(1∶10 000)1 h，ECL顯影檢測蛋白表達。使用Image J 1.48軟件分析蛋白條帶灰度值。

表1 引物信息

1.6 數據統計分析

用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間差異采用t檢驗。結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 H2S對犬血清BUN和Scr的影響

由圖1可知，與C組相比，cis組犬血清中BUN和Scr含量均極顯著增加(P<0.01)，H+cis組Scr含量極顯著增加(P<0.01)；與cis組相比，H+cis組犬血清中BUN和Scr含量均極顯著降低(P<0.01)。

肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖1 各組犬血清中BUN和Scr含量Fig.1 Contents of BUN and scr in serum of dogs in each group

2.2 H2S對順鉑處理犬腎臟組織病理變化的影響

由圖2可知，C組腎臟組織腎小球和腎小管結構正常，球囊腔明顯(a)，血管壁清晰，未觀察到明顯病變。而cis組犬腎臟組織出現大量的炎性細胞浸潤(b)，腎小管上皮細胞變性，管腔內有蛋白性物質(c)，間質血管明顯充血(d)。H+cis組犬腎臟組織可見腎小球囊腔狹窄(e)，腎小管上皮細胞變性(f)。

圖2 各組犬腎臟組織病理學觀察(200×)Fig.2 Histopathological observation of dog kidney tissues in each group (200×)

2.3 H2S對犬腎臟中GSH、H2O2和NO含量的影響

由圖3可知，與C組相比，cis組犬腎臟中GSH含量極顯著降低(P<0.01)，而H2O2和NO含量均極顯著增加(P<0.01)；H+cis組犬腎臟中GSH、H2O2和NO含量均無顯著差異(P>0.05)。與cis組相比，H+cis組犬腎臟中GSH水平極顯著增加(P<0.01)，H2O2和NO含量極顯著下降(P<0.01)。

圖3 各組犬腎臟組織GSH、H2O2和NO含量Fig.3 Contents of GSH,H2O2 and NO in kidney tissues of dogs in each group

2.4 H2S對犬腎臟組織中炎癥相關因子mRNA表達的影響

由圖4可知，與C組相比，cis組犬腎臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、COX2和iNOS的mRNA相對表達量均極顯著增加(P<0.01)，IL-4和IL-10的mRNA相對表達量均極顯著下降(P<0.01)；H+cis組IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB和COX2的mRNA相對表達量均顯著或極顯著增加(P<0.05；P<0.01)，IL-10的相對表達量極顯著下降(P<0.01),IL-4和iNOS的mRNA相對表達量無顯著差異(P>0.05)。與cis組相比，H+cis組犬腎臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、COX2和iNOS的mRNA相對表達量均極顯著下降(P<0.01),IL-4和IL-10的mRNA相對表達量均極顯著增加(P<0.01)。IL-10的mRNA相對表達量極顯著下降而IL-4的mRNA相對表達量無顯著性差異(P>0.05)。

2.5 H2S對犬腎臟組織中中炎癥相關因子蛋白表達的影響

由圖5可知，與C組相比，cis組犬腎臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、COX2和iNOS蛋白相對表達量均極顯著增加(P<0.01);IL-4和IL-10蛋白的相對表達量均極顯著降低(P<0.01)；H+cis組犬腎臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB和iNOS蛋白相對表達量均極顯著增加(P<0.01)，COX2蛋白相對表達量無顯著性差異(P>0.05),IL-4和IL-10的蛋白相對表達量顯著或極顯著降低(P<0.05；P<0.01);與cis組相比，H+cis組犬腎臟組織中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、COX2和iNOS蛋白相對表達量均極顯著降低(P<0.01),IL-4和IL-10蛋白相對表達量均極顯著升高(P<0.01)。

圖4 各組犬腎臟組織中炎癥因子mRNA表達水平Fig.4 Expression levels of mRNA of inflammatory factors in dog kidney tissues in each group

圖5 各組犬腎臟組織中炎癥因子蛋白的表達水平Fig.5 Expression levels of protein of inflammatory factors in dog kidney tissues in each group

3 討 論

H2S最初被認為是一種無色、劇毒、具有特殊臭雞蛋味的氣體，低劑量就能對機體造成損傷。直到1996年，Abe等[8]研究發現，H2S作為一種神經調節介質而發揮重要作用，自此關于動物體內氣體分子H2S的研究成為生物醫學領域的熱點。已有研究證實，H2S參與哺乳動物多種組織的各種病理生理過程并發揮重要作用。外源給予H2S能夠通過減輕氧化應激和線粒體功能障礙來防止心肌結構破壞，緩解心肌缺血再灌注損傷[14]。崔永華等[15]研究發現，外源性H2S可以通過激活海馬組織硫氧還原蛋白系統來降低氧化應激水平，進而緩解蛛網膜下腔出血引起的早期腦損傷。此外，H2S能下調IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子來減輕細胞炎性損傷，發揮抗炎作用[16]。 Sidhapuriwala等[17]研究發現，給予10 mg/kg NaHS可下調小鼠胰腺和肺臟的炎癥反應，并減少促炎趨化因子和黏附因子的表達。Zhang等[18]研究發現，H2S可以降低細胞因子TNF-α、IL-6以及IL-1β的表達來緩解臭氧誘導的小鼠氣道炎癥。然而在獸醫領域中，關于H2S對犬腎臟組織的保護作用鮮有報道。基于此，本研究首次從順鉑造成犬腎臟氧化損傷的角度出發，利用H2S抗氧化、抗炎的特性，探究H2S對順鉑引起的犬AKI是否具有保護作用。

AKI是臨床上常見的疾病，一般治療包括透析和腎臟移植。由于治療成本高導致很難應用到獸醫臨床上，因此探究有效預防AKI手段對獸醫臨床十分重要。血液Scr和BUN是反映腎臟功能的重要指標，當血液Scr和BUN水平短時間內升高，提示AKI的發生[19]。本試驗結果顯示，靜脈注射順鉑72 h后犬血液中Scr和BUN極顯著升高，說明犬AKI模型構建成功。而H2S能下調犬血液中Scr和BUN水平，同時結合組織病理切片結果，提示H2S能有效緩解順鉑誘導的犬AKI。此外，生化指標檢測發現，cis組犬腎臟組織中GSH含量極顯著降低，而H2O2和NO含量極顯著上升。GSH是動物體內一種重要的還原劑，能夠清除動物體內自由基，參與機體多種氧化還原反應。ROS和活性氮(RNS)是動物體內主要氧化物，包括H2O2、羥自由基(·OH)、NO和過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)等。正常生理情況下，機體內氧化與抗氧化處于一個動態平衡，當氧化物在機體內累積過多會引起機體氧化應激[20- 21]。本試驗結果顯示，順鉑誘導犬腎臟組織發生氧化應激，而H2S能夠下調H2O2和NO水平，提高GSH含量進而提高犬腎臟組織抗氧化能力。此外，氧化應激能夠激活免疫活性蛋白如細胞因子和轉錄因子等[22]。NF-κB是動物體內重要的轉錄因子，它不僅可以調控免疫細胞的激活，還廣泛參與機體的應激和炎癥等反應。許多外部刺激如H2O2、TNF-α等均能激活NF-κB通路，進而誘導促炎因子IL-1β和IL-6的生成和釋放。IL-1β是動物體內炎癥反應的核心細胞因子，主要體現在它能誘導其他炎性因子如IL-6、趨化因子和黏附分子等的合成。AKI常表現為腎臟組織發生炎癥反應，Prasada等[23]觀察到AKI患者體內TNF-α、IL-1β和IL-6顯著上升。TNF-α主要是由巨噬細胞產生的一種促炎因子，它可以誘導白介素和干擾素等多肽物質引起炎癥反應[24]。Zhu等[25]報道在小鼠AKI模型中，腎臟中NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著上升。與Zhu等[25]報道相似，本試驗結果顯示，順鉑處理后犬腎臟中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB相對表達量明顯升高，提示腎臟組織發生炎癥。COX2是合成前列腺素的關鍵酶，正常生理情況下在動物體內幾乎檢測不到，當機體受到炎性因子刺激可激活COX2，而抗炎因子如IL-4和IL-10則可抑制機體COX2水平[26]。與COX2相似，正常情況下，細胞內iNOS水平相對較低，但在炎癥等病理情況下其表達會顯著升高[27]，并誘導細胞產生大量的NO，NO又會與超氧陰離子結合生成過氧亞硝基陰離子而引起氧化應激反應[28]，進而損傷組織細胞。本試驗結果顯示，cis組犬腎臟組織中COX2和iNOS相對表達量較對照組明顯升高，進一步表明順鉑誘導犬腎臟組織發生炎癥反應。IL-4和IL-10是動物體內重要的抗炎因子，能限制促炎因子的表達[29-30]。H2S可通過調節細胞因子產生抗炎作用。Li等[31]研究發現，給予外源性H2S能夠降低大鼠肺臟組織中IL-6水平，同時提高抗炎因子IL-10表達進而減輕肺損傷。楊永華等[32]研究發現，用H2S處理大鼠肢體缺血再灌注損傷模型后，大鼠血清中促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α水平明顯下降，提示H2S減輕大鼠局部炎性反應。本試驗結果顯示，H2S預處理可以下調炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB、COX2和iNOS水平，提高IL-4和IL-10相對表達量，說明H2S能夠緩解順鉑誘導的犬腎臟組織炎性損傷。

4 結 論

本試驗結果表明，順鉑通過誘導犬腎臟組織氧化應激，促進腎臟中NF-κB、TNFα、IL-1β、IL-6、COX2和iNOS的表達，并下調IL-4和IL-10水平，導致犬AKI的發生，而H2S預處理可通過提高腎臟組織抗氧化抗炎能力緩解順鉑引起的犬AKI。