超排處理對家兔生殖器官形態及激素水平的影響

王志亮，楊喜喜，鐵雅楠，伏曉玉，王欣榮

(甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070)

胚胎移植(embryo transfer,ET)與超數排卵(superovulation)作為研究動物繁殖的重要技術，對縮短動物繁殖周期，提高生產力水平起到非常重要的作用[1-2]。目前對大部分動物進行超排處理時，常用的激素種類及組合有促卵泡素(follicle-stimulating hormone，FSH)+人絨毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)、FSH+促黃體素(luteinizing hormone，LH)+hCG、孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)+hCG、促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)、雌二醇(estradiol，E2)以及人絕經期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，hMG)等[3]。各種激素因其自身特點在注射方式上也有所不同，由于FSH和LH在動物體內半衰期短，所以需要每天持續注射[4]，而PMSG半衰期較長只需注射一次即可，但首次超排不如FSH、LH等內源性激素的效果好，重復超排效果卻好于FSH等激素[5]。研究表明，家兔采用50 IU PMSG效果不如50 IU PMSG+50 IU hCG，表明PMSG+hCG聯合的超排效果明顯優于PMSG[6]，在有效實現超數排卵的前提下，由于PMSG與hCG具有價格低廉、操作方便的優點，所以在生產中得到廣泛的應用，也能取得很好的經濟效益。有研究表明，在家兔上通過對35 IU hMG+100 IU hCG、10 IU FSH+100 IU hCG和80 IU PMSG+100 IU hCG 3種超排方式比較，發現PMSG+hCG組合超排效果較好，胚胎回收率最高[7]。通過對動物超排后激素變化的研究發現，激素處理能夠引起動物內源性激素變化而改變動物生殖器官生理狀態，達到較好的超排效果[8-9]。

影響超排的因素有很多，如季節、動物的年齡、體重、品種和飼養條件等均會對超排效果造成影響[10]，但最主要的因素還是動物生殖系統對超排激素的反應情況。在超排過程中，通過多種激素的協同調節，會影響卵巢上卵泡發育的時間和數量，使多個卵泡在發育過程中能夠抵抗閉鎖發育成熟而排卵。超排方法主要有恒量法和遞減法，有研究表明，對家兔注射40、 50、 60、 70、 80、 90 IU PMSG 1次，或10 IU FSH 6次恒量注射后再進行12.5～7.5 IU FSH 6次遞減注射，結果表明只要劑量合適2種超排方法均可實現有效超排[11]。家兔屬于常年發情、刺激性排卵的動物，使用超排處理可在短期內獲取大量卵母細胞和胚胎。超排處理涉及到動物下丘腦等性腺軸上發生的一系列生理變化，包括生殖激素的調節與協同反饋、卵巢等不同部位的組織學改變等。現階段主要研究不同超排劑量對超排處理和胚胎的獲取與重復超排對動物繁殖性能的影響，而對超排后動物生殖器官組織形態學變化和內源性血清激素變化研究較少[12-13]。基于本課題組前期對激素用量的篩選(未發表)，本研究用70 IU PMSG+100 IU hCG對家兔進行超排處理，通過生殖器官形態和生殖激素水平的變化來研究其影響，以揭示外源激素干預下家兔激素分泌的變化及生殖器官的組織學特點，以期為超排效果提供形態學和激素水平變化的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 性成熟雌性家兔(伊拉肉兔品系)購自甘肅某養殖有限公司，購入后在甘肅農業大學動物實訓基地進行飼養。經1周適應性飼養后，挑選12只體重大小一致的家兔分為2組，每組6只，單籠飼養，兔舍采用人工控溫與光照，自由采食飲水，屠宰時體重為(3.38±0.01) kg。

1.1.2 主要試劑及儀器 PMSH和hCG均購自寧波第二激素廠；蘇木精染液(武漢谷歌生物科技有限公司)、無水乙醇、二甲苯、鹽酸和中性樹膠均購自國藥集團化學試劑有限公司；抑制素(inhibin，INH)、FSH、LH、孕酮(progesterone，P4)和E2激素測定試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。石蠟切片機(RM2016)購自Leica公司；正置光學顯微鏡購自尼康公司；游標卡尺(0～500 mm)購自上海恒量量具有限公司，；自動脫水機(JJ-12J)、包埋機(JB-P5)和凍臺(JB-L5)均購自武漢俊杰電子有限公司；組織攤片機(KD-P)和烘片機(KD-H)購自浙江金華科迪儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物的處理及樣品采集 將12只動物分為試驗組和對照組，每組6只。給試驗組家兔大腿內測注射70 IU PMSG，72 h后在相同位置注射100 IU hCG，對照組均對應注射等體積生理鹽水。試驗組和對照組家兔均采取與雄兔合籠刺激誘導排卵，合籠24 h處死采集卵巢、輸卵管、子宮等樣品，現場測量各樣品物理參數后，4%多聚甲醛固定。分別在注射PMSG前、注射hCG前及處死前采集對照組和試驗組家兔耳緣靜脈血，3 000 r/min離心5 min，吸取上層血清于-20 ℃保存備用。

1.2.2 生殖器官物理參數測量 用游標卡尺測量卵巢的長、寬和厚，輸卵管長、輸卵管壺腹部、峽部及漏斗部的寬度，子宮的長度、寬度、周長及子宮壁的厚度，并統計排卵點數及充血卵泡數。

1.2.3 組織切片的制備 對家兔生殖器官的物理數據測量后，將卵巢、輸卵管和子宮分離，在4%多聚甲醛中固定24 h后，對卵巢進行修塊，經二甲苯、梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片、攤片、沾片、烤片、二甲苯脫蠟、蘇木精染色、鹽酸分化、水洗、伊紅染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，將制備好的卵巢切片置于顯微鏡下鏡檢，選取3個以上不同視野進行拍照并采集照片，運用Image-Pro Plus 6.0軟件測量卵泡直徑和卵母細胞直徑。

1.2.4 血清激素測定 按照試劑盒說明書采用ELISA法測定血清中INH、FSH、LH、P4和E2含量。

1.3 數據統計分析

激素測定數據用Excel 2010統計，用SPSS 25.0進行獨立樣本t檢驗分析，結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 超排對卵巢組織形態的影響

家兔卵巢呈紡錘形，質感較硬不易變形，表面有大小不等的卵泡突出，經超排處理后卵巢體積明顯變大，表面卵泡、充血卵泡和排卵點增多(圖1)。與對照組相比，試驗組卵巢重量、長度、寬度和厚度均極顯著增加(P<0.01)；卵巢上的排卵點數、充血卵泡數、閉鎖卵泡數均極顯著增多(P<0.01)(表1)。通過對卵巢切片的觀察發現，超排后家兔卵巢皮質內有大量的卵泡發育，而對照組發育卵泡數量相對較少，同時2組都有一定數量的黃體存在，且試驗組的黃體數量較多，而對照組中可見的黃體數量較少且已經發生退化(圖2)。

2.2 超排對卵泡和卵母細胞的影響

由表2可知，與對照組相比，除次級卵泡直徑顯著減小外(P<0.05)，其他各級卵泡的直徑均差異不顯著(P>0.05)，卵泡內卵母細胞的直徑差異也不顯著(P>0.05)。

由圖3可知，無論是否有超排處理，家兔卵巢的組織學特征相似，即隨著卵巢皮質表層大量原始卵泡的發育，其周圍出現了單層卵泡細胞層，此時原始卵泡發育為初級卵泡，隨后出現透明帶而發育為次級卵泡，之后隨著卵泡腔的出現則發育為三級卵泡，并幾乎占據整個皮質層。在卵泡發育的各個階段大部分卵泡發生閉鎖，且腔前卵泡和有腔卵泡有著不同的閉鎖方式，僅有少部分優勢卵泡發育為成熟卵泡并排卵。

A，對照組；B，試驗組A,Control group;B,Experimental group圖1 各組卵巢形態觀察Fig.1 Observation of ovary morphology in each group

①A，對照組；B，試驗組。②TA，白膜；C，皮質；M，髓質；F，卵泡；CL，黃體①A,Control group;B,Experimental group.②TA,Tunica albuginea;C,Cortex;M,Medulla;F,Follicle;CL,Corpus luteum圖2 各組卵巢組織形態(100×)Fig.2 Ovarian tissue morphology in each group (100×)

表2 各組不同級別卵泡和卵母細胞直徑

PRF，原始卵泡；PF，初級卵泡；SF，次級卵泡；PO，初級卵母細胞；ZP，透明帶；IC，間質細胞；FA，卵泡腔；SG，顆粒層；TFI，卵泡內膜；TFE，卵泡外膜；AF，閉鎖卵泡PRF,Primitive follicles;PF,Primary follicle;SF，Secondary follicle;PO,Primary oocyte;ZP,Zona pellucida;IC,Interstitial cells;FA,Follicular cavity;SG,Stratum granulosum;TFI,Theca folliculi intern;TFE,Theca folliculi externa;AF,Atresia follicles圖3 各組不同級別卵泡組織形態Fig.3 The histological morphology of follicles of different grades in each group

2.3 超排前后子宮和輸卵管的組織形態學變化

由表3可知，與對照組相比，試驗組輸卵管長度和壺腹部寬度均顯著增加(P<0.05)，漏斗部寬度極顯著增加(P<0.01)。由表4可知，與對照組相比，試驗組子宮長度極顯著增加(P<0.01)，子宮寬度顯著增加(P<0.05)；子宮周長和子宮壁厚小于對照組，但差異均不顯著(P>0.05)。

表3 輸卵管物理參數測定結果

表4 子宮物理參數測定結果

2.4 超排前后生殖激素水平的變化

對照組家兔血清INH水平隨處理時間延長呈遞增趨勢，與對照組相比，在注射PMSG前和hCG前試驗組INH含量均顯著降低(P<0.05)(圖4A)；與對照組相比，在注射hCG前試驗組FSH含量顯著增加(P<0.05)，處死前FSH顯著降低(P<0.05)(圖4B)；試驗組血清中LH無明顯變化，對照組血清中LH含量先降低后上升，且注射hCG前和處死前試驗組LH含量均顯著高于對照組(P<0.05)(圖4C)；試驗組與對照組血清中P4含量變化均不明顯，但都有下降趨勢，且2組間差異不顯著(P>0.05)(圖4D)；對照組血清中E2含量呈現先增后減的變化趨勢，而在試驗組中基本無變化，且2組間差異不顯著(P>0.05)(圖4E)。

①Ⅰ，注射PMSG前；Ⅱ，注射hCG前；Ⅲ，處死前。②*，差異顯著(P<0.05)；無*，差異不顯著(P>0.05)①Ⅰ,Before the injection of PMSG;Ⅱ,Before the injection of hCG;Ⅲ,Before the slaughtering.②*,Significant difference(P<0.05)；No *,No significant difference(P>0.05)圖4 血清激素INH(A)、FSH(B)、LH(C)、P4(D)和E2(E)在不同時期的含量Fig.4 Contents of serum hormone INH (A),FSH (B),LH (C),P4 (D) and E2(E) in different periods

3 討 論

3.1 超排處理對家兔生殖器官形態及組織學特征的影響

相較于FSH、LH等激素超排方案，PMSG與hCG價格低廉且操作方便[14]。PMSG能夠促使卵巢中卵泡快速發育，而與卵母細胞一起構成卵泡的體細胞(卵泡細胞、顆粒細胞和內膜細胞)的分化則是其生長的主要原因[15]。本研究結果表明，在卵泡發育過程中，外源激素的處理對大多數卵泡直徑無影響，但能顯著減小次級卵泡的直徑。Downs[16]研究表明，PMSG可以促使卵巢中卵泡的同步發育，能夠使次級卵泡快速發育成三級卵泡，說明PMSG主要作用于生長卵泡的發育，但對卵泡內的卵母細胞大小無顯著影響。本研究發現，試驗組卵巢中有大量的閉鎖卵泡，且各級閉鎖卵泡的組織結構不完全相同。在閉鎖的原始卵泡中，卵母細胞會先塌縮退化后消失，初級卵泡和次級卵泡閉鎖形式為透明帶塌縮以及卵母細胞核固縮后消失。而在閉鎖的有腔卵泡中，首先卵母細胞退化消失，隨后顆粒細胞逐漸充滿整個卵泡腔后致密化，最后顆粒細胞凋亡消失。有研究指出，小尾寒羊生長卵泡的閉鎖有2種形態，一種是實心卵泡，另一種是囊狀卵泡[17]。這與本研究觀察到的家兔卵泡的閉鎖方式有所不同。在東北虎的卵巢中，卵泡閉鎖體現在卵母細胞退化消失，透明帶松散褶皺，顆粒細胞間疏松結合超1/3[18]。研究顯示，東北梅花鹿卵泡的閉鎖主要有2種類型，第一種普遍發生于原始卵泡、初級卵泡和次級卵泡中，表現為卵母細胞發生退行性變化，是卵泡閉鎖的主要形式；第二種主要發生于三級卵泡中，表現為卵泡細胞核致密化，細胞質空泡化并瓦解[19]。在本研究中家兔卵泡的閉鎖狀態與梅花鹿的相似，即在無腔卵泡和有腔卵泡中存在2種閉鎖類型，但不同物種之間不同類型的閉鎖差異的具體原因尚需進一步研究。另外本研究也顯示，對照組中的閉鎖卵泡數少于試驗組，這可能是超排處理使卵泡大量發育的同時，卵泡的閉鎖也有所增加所致。

PMSG能夠使動物卵巢中卵泡大量發育生長，卵巢基質增加[20]，使得卵巢體積增大，重量增加。本研究觀察到，與對照組相比，試驗組卵巢的皮質和髓質中的細胞數量多且排列緊密，另外結締組織和血管也表現出增多和變大的趨勢。胡鵬飛等[21]的研究發現，4 IU PMSG處理對小鼠子宮的增大也有影響，本研究也檢測到輸卵管和子宮在處理前后有部分形態發生顯著變化。因此,本研究通過70 IU PMSG+100 IU hCG的激素組合對家兔進行超排處理，會對家兔卵巢的形態及組織學特征產生一定的影響，如卵巢增大、排卵點以及黃體數目增多等，且對輸卵管、子宮大小也有影響，但對成熟卵泡和卵母細胞的直徑沒有顯著影響。

3.2 超排處理對家兔血清生殖激素分泌的影響

INH是抑制垂體促性腺激素細胞分泌FSH的主要調節因子之一。在促性腺激素的作用下，卵巢顆粒細胞和膜細胞合成并分泌INH[22-23]。Meng等[24]研究發現，卵泡內抑制素的表達水平取決于卵泡的發育階段，說明INH是卵泡發育能力的重要影響因子。在新發育的優勢卵泡中分泌的抑制素B(INHB)具有2個功能[25]：一是負反饋調節垂體分泌FSH，二是與LH局部協同作用，增加膜細胞分泌雄激素的能力[26]。在雌性動物的發情周期，垂體分泌的LH通過血液循環到達卵巢，協調垂體分泌的FSH刺激卵母細胞和卵泡發育，促進雌激素的分泌釋放，在形成LH峰后促進排卵[27]。PMSG具有FSH相似的功能，能夠促進卵泡的發育，且具有LH的部分功能，能夠促進卵泡排出和黃體的形成。本研究中，在PMSG注射后INH一直呈遞減趨勢，且在注射hCG后顯著低于對照組，說明超排處理使INH濃度降低，INH對FSH的分泌抑制作用減小，PMSG和hCG與INH協同作用促使FSH升高，刺激更多卵泡成熟，使卵巢能夠排出大量成熟卵母細胞，促進卵巢顆粒細胞的增生和雌激素的分泌，在卵母細胞排出后FSH濃度會發生下降[28]，而家兔為刺激排卵動物，試驗組在注射完hCG交配后刺激卵母細胞排出與外源性激素反饋影響FSH濃度迅速下降。而PMSG和hCG均有類似LH的作用，與自身LH共同作用從而導致LH處于較高濃度并發生了鈍化，但LH濃度一段時間內仍然維持相對較高的水平，說明處理也能夠起到延長妊娠的作用。

卵巢內雌激素主要分泌部位為卵泡的顆粒細胞，主要包括E2和雌酮，而且兩者可互相轉化。雌激素通過對下丘腦的反饋作用，調節促性腺激素釋放激素和促性腺激素分泌，在促進卵泡發育，調節發情周期起重要作用[28]。有研究發現，PMSG超排處理豬后其E2在72 h之前緩慢增長，在72 h達到最高，隨后濃度降低[29]，本研究在家兔中也發現了類似的結果，但與對照組相比差異不顯著。孕酮主要來源于卵巢的黃體細胞，其中P4是孕激素中活性最高的，也是雌激素和雄激素的共同前體。有研究表明，對水牛和豬注射PMSG超排后，P4濃度會降低[29-30]，本試驗結果與水牛和豬上的結果一致，說明超排處理對孕酮水平的降低作用是一致的，但降低程度因物種而異。由此可見，采用70 IU PMSG+100 IU hCG激素組合對家兔進行超排處理對E2和P4的分泌量并不會產生顯著影響。

4 結 論

用70 IU PMSG+100 IU hCG的激素對兔進行超排處理，可使卵巢體積增大、表面的排卵點數增多，黃體和閉鎖卵泡數目增多，血清中INH濃度降低、FSH和LH濃度升高，且外源性與內源性激素協同作用于卵巢，實現穩定的超排效果。