促性腺激素抑制激素對SD大鼠性腺生殖功能與糖代謝的影響

胡 文，霍孔林，宋星星，張 鑫，張多妮，羅榮榮，徐文鎬，李 珣

(廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004)

促性腺激素抑制激素(GnIH)是動物體內重要的神經內分泌激素，由Tsutsui等[1]于2000年首次在鵪鶉的下丘腦中分離得到，其可通過抑制促性腺激素(GnRH)的合成和釋放而影響性腺的發育，同時調控動物的生殖。后續研究還發現了一種與GnIH互為同源的具有酰胺結構的神經肽，研究人員將其命名為RF酰胺相關肽3(RFRP-3)[2]。GnIH在動物體內生殖系統廣泛分布和表達。Zhang等[3]研究發現，睪丸和卵巢中均有GnIH的表達，說明GnIH作為一種神經肽參與調控機體內生殖系統的生理活動。Muoz-Cueto等[4]研究發現，GnIH會影響動物的攝食；Ubuka等[5-6]研究表明，GnIH對動物的性行為和能量代謝等方面都有影響。Ubuka等[7]進一步證實了GnIH還影響動物性腺的生長、發育。Huo等[8]首次證實了GnIH參與大鼠的糖代謝穩態調控并導致葡萄糖耐量受損。目前，研究已初步驗證了GnIH參與了大鼠的糖代謝并影響了其生殖功能，但是對于GnIH在其中的作用機制尚未進一步闡述。因此，本研究通過對SD大鼠腹腔注射不同劑量的GnIH，使用HE染色、實時熒光定量PCR等技術更深入地探索GnIH對SD大鼠性腺生殖功能和糖代謝的影響，并分析生殖功能和糖代謝之間的相關性，為進一步探索GnIH在動物生殖和能量代謝中的作用機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

大鼠GnIH(048-46)購自Phoenix Pharmaceuticals公司；Trizol、RNA酶抑制劑、反轉錄酶、TaqDNA聚合酶、PCR Master Mix及2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。電子分析天平(BSM-520.3)購自上海卓精電子科技有限公司；實時熒光定量PCR儀(Light Cycler 96)購自Roche公司；輪轉式切片機(RM2235)購自Leica公司。

1.2 試驗動物飼養管理、分組及處理

5周齡SD大鼠36只(雌雄各半)，體重為(190±10)g，購自廣西醫科大學實驗動物中心。SD大鼠采用單籠飼養，自由采食和飲水，飼養環境控制在統一標準下(溫度：24 ℃±2 ℃，濕度：50%±10%，光照控制：12L+12D，每天早上07:00開燈)。適應飼養7 d后，參考Huo等[8]的方法將SD大鼠隨機分為對照組(0.9%生理鹽水)、1 μg/100 μL GnIH(Ⅰ組)、10 μg/100 μL GnIH(Ⅱ組)，每組12只，雌雄各半。每天07：00和19：00注射生理鹽水或GnIH，200 μL/次，連續注射14 d。14 d后，先稱量體重，再麻醉[9]處死，分別取出卵巢和睪丸并稱重，將一部分樣品置于4%多聚甲醛溶液中固定，一部分放入液氮速凍處理后移入-80 ℃保存備用。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 肥胖程度 稱量SD大鼠初始體重和處死前體重，肥胖程度=終體重-初始重。

1.3.2 卵體比和睪體比 按如下公式計算大鼠的卵體比和睪體比[10]。

卵體比=卵巢重量/體重

睪體比=睪丸重量/體重

1.3.3 卵巢和睪丸組織切片 取4%多聚甲醛溶液中固定的卵巢和睪丸樣品，制作石蠟切片，HE染色，中性樹脂封片后顯微鏡下觀察。

1.3.4 發情周期 采用陰道涂片法[11]，連續14 d在注射時用棉簽沾取大鼠的陰道分泌物(每天07：00和19：00各1次)，將其均勻地涂抹在含有0.9%生理鹽水的載玻片上，自然晾干后進行HE染色，顯微鏡下觀察。根據陰道涂片的細胞變化特點來區分不同的發情周期階段，分別為發情前期、發情期、發情后期和發情間期4個階段組成。具體判斷方法如下：發情前期主要為上皮細胞；發情期主要為無核多邊形細胞，還有少量上皮細胞；發情后期主要特征是白細胞大量出現；發情間期上皮細胞、無核多邊形細胞、白細胞均可見。

1.3.5 精子活力 處死大鼠后，立即取出附睪，將附睪內的精子用移液槍吸出，將精子放入滴有0.9%生理鹽水的載玻片上，小心吹打混勻，蓋上蓋玻片后，顯微鏡下觀察。根據顯微鏡下活躍精子與全部精子的百分比判斷各組精子的活力[12]。

精子活力(%)=活躍精子數/總精子數×100%

1.3.6 糖代謝及炎癥相關基因的檢測 按照Trizol法提取各組卵巢和睪丸組織總RNA，反轉錄合成cDNA。根據GenBank中胰島素受體(IR)、葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素(IL-1β)和β-actin基因的序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物均由深圳華大基因科技有限公司合成。引物具體信息見表1。以β-actin為內參基因，進行實時熒光定量PCR。 PCR反應體系20 μL：TaqDNA聚合酶10 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s,共38個循環。采用2-ΔΔCt法計算所檢測基因mRNA相對表達量。

表1 引物信息

1.4 SD大鼠性腺生殖功能與糖代謝之間的相關性分析

通過SPSS 22.0軟件分析腹腔注射不同濃度GnIH組的SD大鼠性腺生殖功能(發情周期和精子活力)與糖代謝(GLUT4與IR基因的表達)之間的皮爾遜指數和P值[13-14]。將雌性SD大鼠性腺中的卵體比、發情周期的指標與糖代謝相關因子IR、GLUT4基因的表達水平進行相關性分析；將雄性SD大鼠性腺中的睪體比、精子活力的指標與糖代謝相關因子IR、GLUT4基因的表達水平進行相關性分析。皮爾遜指數的范圍在-1到1之間，通過數值的正負判斷兩者為正相關還是負相關，P值的大小判斷相關性是否顯著。P<0.05為顯著相關。

1.5 數據統計分析

用SPSS 17.0進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，用LSD法進行多重比較，結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 GnIH對大鼠肥胖程度的影響

由圖1可知，與對照組相比，Ⅰ組雌性大鼠的肥胖程度顯著升高(P<0.05)(圖1A)，Ⅱ組雄性大鼠肥胖程度顯著升高(P<0.05)(圖1B)。

肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖6～9同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as fig.6-fig.9圖1 各組雌(A)、雄(B)大鼠肥胖程度Fig.1 Obesity degree of female (A) and male (B) rats in each group

2.2 GnIH對大鼠性腺表觀指標的影響

由表2可知，與對照組相比，Ⅰ、Ⅱ組大鼠卵巢的大小均顯著增加(P<0.05)，Ⅱ組大鼠卵巢重量和卵體比均顯著增加(P<0.05),睪丸重量和睪體比均顯著降低(P<0.05)，睪丸的大小沒有顯著變化(P>0.05)。

表2 各組大鼠性腺大小及性腺/體重

2.3 GnIH對大鼠性腺形態學的影響

2.3.1 GnIH對雌性大鼠卵巢組織形態的影響 由圖2可知，與對照組相比，Ⅱ組大鼠卵巢中的卵泡呈囊性擴張，顆粒細胞層減少，卵泡腔增大。Ⅰ組無明顯變化。

2.3.2 GnIH對雄性大鼠睪丸的影響 由圖3可知，與對照組比較，Ⅰ組大鼠生精小管中出現“空泡樣”改變，Ⅱ組睪丸切片“空泡樣”改變比Ⅰ組更明顯，并且Ⅰ與Ⅱ組都出現生精細胞排列紊亂、層次減少的變化。

□，局部放大。圖3同□，Local amplification.The same as fig.3圖2 各組雌性大鼠卵巢組織形態Fig.2 Ovarian tissue morphology of female rats in each group

圖3 各組雄性SD大鼠睪丸組織形態Fig.3 Testicular tissue morphology of male rats in each group

2.4 GnIH對大鼠生殖功能的影響

2.4.1 GnIH對雌性大鼠發情周期的影響 發情周期的不同階段可通過顯微鏡下陰道涂片(圖4)細胞的種類進行推斷。由表3可知，與對照組相比，Ⅱ組大鼠發情前期的持續時間顯著增加(P<0.05)，而發情期、發情后期以及間情期無明顯變化(P>0.05)。

A，發情前期；B，發情期；C，發情后期；D，發情間期A,Proestrus;B,Estrus;C,Metestrus;D,Diestrus圖4 發情周期不同階段的判斷(100×)Fig.4 Judgement of each phase of estrous cycle (100×)

表3 各組雌性大鼠發情周期各階段的持續時間

2.4.2 GnIH對雄性大鼠精子活力的影響 由表4可知，與對照組相比，Ⅱ組總精子數量顯著下降(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ組活躍精子數均顯著下降(P<0.05)，Ⅱ組活躍精子百分比顯著降低(P<0.05)。由圖5可知，與對照組相比，Ⅰ、Ⅱ組大鼠精子均未發現畸形、卷曲等形態變化。

表4 各組雄性SD大鼠的精子活力

A～C，分別為對照組、Ⅰ和Ⅱ組A-C,Control,Ⅰ and Ⅱ groups,respectively圖5 各組SD大鼠精子形態(100×)Fig.5 Sperm morphology of rats in each group (100×)

2.5 GnIH對大鼠性腺糖代謝的影響

由圖6可知，與對照組相比，Ⅱ組雌性大鼠IR基因表達量顯著降低(P<0.05)、Ⅰ、Ⅱ組GLUT4基因表達量極顯著下降(P<0.01)；Ⅰ、Ⅱ組雄性大鼠GLUT4基因的表達量均極顯著下降(P<0.01,圖7)，而Ⅰ、Ⅱ組IR基因表達量雖有下降，但均無顯著性差異(P>0.05)。

2.6 GnIH對大鼠性腺炎癥反應的影響

由圖8可知，與對照組相比，Ⅰ組雌性大鼠卵巢中TNF-α和IL-1β基因的相對表達量均顯著升高(P<0.05)，Ⅱ組TNF-α基因的相對表達量極顯著升高(P<0.01)；由圖9可知，與對照組相比，Ⅱ組雄性大鼠TNF-α基因的相對表達量極顯著升高(P<0.01)，Ⅰ組IL-1β基因的相對表達量顯著升高(P<0.05)。

圖6 各組雌性大鼠卵巢中IR(A)和GLUT4(B)基因的相對表達量Fig.6 The relative expression of IR (A) and GLUT4 (B) genes in ovaries of female rats in each group

圖7 各組雄性SD大鼠睪丸中IR(A)和GLUT4(B)基因的相對表達量Fig.7 The relative expression of IR (A) and GLUT4 (B) genes in testis of male rats in each group

圖8 各組雌性大鼠卵巢中TNF-α(A)和IL-1β(B)基因的相對表達量Fig.8 The relative expression of TNF-α (A) and IL-1β (B) genes in ovaries of female rats in each group

圖9 各組雄性大鼠睪丸中TNF-α(A)和IL-1β(B)基因的相對表達量Fig.9 The relative expression of TNF-α (A) and IL-1β (B) genes in testis of male rats in each group

2.7 SD大鼠性腺生殖功能相關指標與糖代謝相關基因的相關性分析

由表5可知，GnIH處理后，大鼠的卵體比與GLUT4基因的表達水平呈極顯著正相關(P<0.01)，與IR基因的表達水平呈顯著正相關(P<0.05)；卵巢的發情周期與GLUT4基因的表達水平呈極顯著負相關(P<0.01)，與IR基因的表達水平無顯著相關性(P>0.05)；大鼠睪體比與GLUT4基因的表達水平均呈顯著正相關(P<0.05)；大鼠精子活力與GLUT4基因的表達水平均呈極顯著正相關(P<0.01);大鼠睪體比、精子活力與IR基因無顯著相關性(P>0.05)。

表5 大鼠性腺生殖功能相關指標與糖代謝的相關性分析

3 討 論

GnIH作為廣泛分布在動物體內的神經內分泌激素，能夠刺激SD大鼠的食欲而增加其體重，如Tachibana等[15]研究發現，GnIH可有效地刺激SD大鼠的進食量；Huo等[8]研究發現，GnIH通過增加大鼠的食欲而增加體重。本試驗結果顯示，腹腔注射10 μg/100 μL GnIH后雌雄SD大鼠的體重均增加，且雌性SD大鼠的卵體比增加，雄性SD大鼠的睪體比下降，說明GnIH可能使SD大鼠的性腺發生生理性變化。HE染色結果顯示，10 μg/100 μL GnIH組卵巢的卵泡發生囊性擴張，顆粒細胞層減少，卵泡腔增大；10 μg/100 μL GnIH組睪丸的生精小管有“空泡樣”改變，并且生精細胞排列紊亂、層次減少，說明腹腔注射GnIH抑制SD大鼠性腺的發育。Johnson等[16]研究發現，GnIH能夠抑制大鼠促黃體素(LH)的分泌從而影響性腺的功能；Singh等[17]研究發現，RFRP-3能抑制卵巢孕酮的合成從而抑制卵巢的功能。RFRP3/GPR147信號通路參與雌性大鼠青春期的發育和性成熟的過程[18]。GnIH神經元投射到下丘腦區域和細胞參與生殖功能[19]。本研究結果顯示，雌性SD大鼠的發情周期紊亂，雄性SD大鼠的精子活力下降，說明GnIH對大鼠的生殖功能有抑制作用，具體表現為抑制雌性的排卵和雄性的精子活力，說明GnIH能直接作用于SD大鼠的性腺從而抑制睪丸或卵巢的活力。

隨著研究的深入，Arble等[20]研究發現，GnIH參與了能量代謝的過程。有研究表明，肥胖大鼠下丘腦-垂體-性腺軸神經調控中樞的代謝水平整體處于抑制狀態，從而影響糖代謝在體內的葡萄糖穩態。在外源GnIH[21]作用下，GLUT4基因在卵巢和睪丸中的表達下降。本試驗結果顯示，10 μg/100 μL GnIH組雌性SD大鼠卵巢中IR基因表達水平顯著降低，1、10 μg/100 μL GnIH組雌雄性SD大鼠睪丸中GLUT4基因的表達量均極顯著降低，說明腹腔注射GnIH使SD大鼠性腺的糖代謝功能紊亂，與上述試驗結果一致。此外，張多妮等[22]研究顯示，腹腔注射RFRP-3后大鼠脾臟內的TNF-α和IL-1β基因的表達量增高。本試驗結果表明，腹腔注射GnIH后，雌雄大鼠性腺中TNF-α和IL-1β基因的表達水平均升高，說明大鼠性腺發生了炎性反應。Chabrolle等[23]研究發現，卵巢內葡萄糖濃度的變化會影響卵巢功能。本試驗結果顯示，雌性大鼠的卵體比、與糖代謝相關因子IR、GLUT4基因的表達水平呈極顯著強相關，發情周期與GLUT4基因的表達水平呈極顯著負相關，雄性大鼠睪體比、精子活力指標與糖代謝相關因子GLUT4基因的表達水平呈顯著或極顯著正相關，說明GnIH參與調控雌雄SD大鼠性腺的生殖功能與糖代謝過程，推測GnIH在這兩者中間擔任“信使”的功能，可作為它們之間的聯絡因子。

4 結 論

本研究結果顯示，腹腔注射10 μg/100 μL GnIH后，大鼠體重增加，卵泡發生囊性擴張，生精小管有空泡樣改變，發情周期紊亂，精子活力降低，性腺中糖代謝基因IR、GLUT4表達量除睪丸中IR基因表達無變化，其他均下降，炎癥相關基因TNF-α和IL-1β的表達量均增加；除卵體比與IR基因有強正相關性之外，雌雄大鼠性腺的生殖功能(卵體比、發情周期、睪體比、精子活力)與糖代謝基因GLUT4之間均有強相關性。說明腹腔注射GnIH不僅能夠抑制SD大鼠的生殖功能，導致糖代謝功能紊亂，而且GnIH可能參與性腺生殖功能和糖代謝之間的交叉對話，作為它們之間的一種新的聯絡因子而參與整個過程。