不同品種豬PBD-124基因多態性及差異表達研究

高倍瑤，劉艷光，賈 琪，柳儉強，羅新惠，張立春

(1.吉林農業大學動物科技學院，長春 130000；2.吉林省農業科學院動物生物技術研究所，公主嶺 136100；3.延邊大學農學院，延吉 130021)

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)又稱宿主防御肽或抗微生物肽，是一類宿主經病原微生物誘導所分泌且能夠對抗病原體的小分子多肽[1]。在過去的幾十年里，AMPs因其對細菌、真菌及病毒具有獨特的抗菌活性能有效降低細菌耐藥性，具有生物相容性，具有成為新型治療藥物替代品的廣闊發展前景[2-4]。AMPs的產生是宿主和病原在自然界長期協同進化的結果，動物體內的AMPs主要由吞噬細胞和黏膜上皮細胞產生，并通過蛋白質水解作用形成具有生物活性的成熟肽。成熟的AMPs具有廣泛的抗病原體譜系[5]，對自然界的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、寄生蟲、病毒及腫瘤細胞的天然免疫都起著重要作用[6]。防御素是廣泛分布于動物、植物、昆蟲體內具有6個半胱氨酸殘基和3個分子鏈間二硫鍵的陽離子內源性AMPs[7]，在牛、馬、羊、豬、鹿及駱駝等家畜體內廣泛表達[8]。根據半胱氨酸殘基之間的不同聯系，哺乳動物防御素可分為α、β和θ 3種，從進化的角度來看，β-防御素是最古老的防御素[3]。在豬體內，僅發現了β-防御素[9]且表達極為廣泛，Choi等[10]在豬的消化道、呼吸道、脾臟、淋巴結、腦、心臟、肝臟、腎臟、膀胱、睪丸、皮膚、肌肉、骨髓、外周血、嗜中性粒細胞、肺泡巨噬細胞以及臍帶中均檢測到豬β-防御素-1(porcine beta-defensin-1，PBD-1)mRNA表達。β-防御素因其在豬體內廣泛表達和其對微生物的廣譜抗性、調節先天免疫的能力，具有開發成為良好的外源性抗生素替代品的潛質[11]，是目前研究最深入、廣泛的一類防御素，目前已發現了29種PBD[10]，但并未發現針對豬PBD-124基因的報道。鑒于此，本試驗以大白豬、民豬和野雜豬3個群體為研究對象，采用RT-PCR方法擴增并克隆PBD-124基因；利用PCR-RFLP限制性核酸內切酶BlnⅠ對突變位點進行酶切，檢測該基因的多態性；利用實時熒光定量PCR方法檢測該基因在不同品種豬組織中的差異表達情況，以期為進一步探究PDB-124基因的生物學功能及免疫防御相關的候選基因提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于吉林省白山市隆興牧業有限公司興降豬場選取野雜豬31頭(民豬與野豬雜交豬，含75%長白山野豬血統);于吉林省農業科學院畜牧分院民豬保種場民豬34頭;于四平紅嘴集團梨樹種豬場選取純種大白豬31頭，3個品種豬均為5～6月齡。采集3個品種96頭豬血樣，用抗凝血管收集，-20 ℃保存備用。屠宰后取肝臟和脾臟，用滅菌剪刀剪成小塊，放入凍存管并做好標記，于液氮中保存備用。

1.2 主要試劑及儀器

Blood Genomic DNA提取試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；Trizol購自Invitrogen公司；PrimeScript?RT MasterMix反轉錄試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞、2×ESTaqMasterMix 均購自北京康為世紀生物科技有限公司；Gel Extraction Kit膠回收試劑盒購自Omega公司。Light Cycler 480 SYBR Green Ⅰ Master和實時熒光定量PCR儀均購自羅氏公司；梯度PCR儀購自北京博輝生物科技有限公司。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中PBD-124基因mRNA預測序列(登錄號：XM_013983105)，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物擴增PBD-124基因CDS區；根據PBD-124基因突變位點，利用Beacon Designer 7.0軟件設計PCR-RFLP酶切引物和實時熒光定量PCR引物，以豬HPRT1為內參基因，引物信息見表1。 引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 豬PBD-124基因克隆及測序

1.4.1 DNA、總RNA提取及cDNA合成 按照Blood Genomic DNA試劑盒說明書提取3個品種豬血液基因組DNA。采用Trizol法提取3個品種豬肝臟、脾臟和血液總RNA，采用Quawell-Q5000超微量分光光度計對純度及濃度進行檢測。參照PrimeScript?RT MasterMix反轉錄試劑盒使用說明進行cDNA合成，-20 ℃保存備用。

1.4.2 PCR擴增、克隆及測序分析 以3個品種豬cDNA為模板，擴增PBD-124基因CDS區。PCR反應體系20 μL：2×EsTaqMasterMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O補足體系。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，參照Gel Extraction Kit膠回收試劑盒切膠回收，取回收產物與pMD18-T載體進行連接，連接體系10 μL：回收產物4.5 μL，pMD18-T載體0.5 μL，Solution 5 μL。16 ℃連接1 h。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，加入450 μL LB培養液(不含AMP+)置于37 ℃搖床220 r/min震蕩培養45 min使菌體復蘇，取200 μL復蘇菌液用一次性涂布棒均勻涂在固體LB平板上(含AMP+)，37 ℃倒置培養12～16 h，挑取單個菌落置于1 L液體LB(含AMP+)中37 ℃搖床220 r/min震蕩培養10 h。取鑒定正確的陽性克隆產物送測，并對測序結果進行比對分析。

1.5 PCR-RFLP法檢測豬PBD-124基因多態性

以3個品種豬所提取的DNA為模板，根據PCR-RFLP所設計的引物進行PBD-124基因擴增。PCR反應體系20 μL：2×EsTaqMasterMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 0.5 μL，ddH2O補足體系。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34 個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用限制性內切酶BlnⅠ對豬PBD-124基因目的片段進行酶切，反應體系10 μL：BlnⅠ 0.5 μL，10×K Buffer 1 μL，PCR產物5 μL，ddH2O補足體系。37 ℃水浴4 h。酶切產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳進行基因型檢測。

1.6 遺傳多樣性分析

分析PBD-124基因不同基因型的基因頻率和基因型頻率，計算遺傳純合度(Ho)、遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(Ne)和多態信息含量(PIC)，通過卡方檢驗分析基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態。

1.7 實時熒光定量PCR檢測不同品種豬不同組織中PBD-124基因的表達

采用實時熒光定量PCR檢測PBD-124基因在大白豬、民豬和野雜豬的肝臟、脾臟和血液中的表達情況，并比較相同組織不同品種和相同品種不同組織間的差異表達。 PCR反應體系20 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×SYBR Premix Dimer Eraser 10 μL，ddH2O補足體系。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸35 s，共45 個循環；95 ℃變性5 s，60 ℃遞增到97 ℃最后降到40 ℃保存。每組試驗重復3次，采用2-△△Ct方法對數據進行分析。

1.8 數據分析

使用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，組間比較采取t檢驗，結果以平均值±標準誤表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 PBD-124基因CDS區PCR擴增及測序

以野雜豬、民豬和大白豬的血液cDNA為模板，PCR產物片段大小約500 bp(圖1)，與預期相符。克隆測序發現，目的條帶全長500 bp；BLASTN比對發現，該片段與PBD-124基因預測mRNA序列(登錄號：XM_013983105)高度同源，其中，包含完整CDS序列423 bp，共編碼140個氨基酸。序列比對發現，PBD-124基因存在2個突變位點：c.257 G>A和c.263 T>C，但均沒有引起氨基酸的改變。因2個突變位點間隔過近，可能存在連鎖，僅對第1個突變位點進行酶切分型。

2.2 PBD-124基因PCR-RFLP酶切分型

由圖2可知，PBD-124基因產物片段大小約為700 bp，與預期一致，可用于下一步酶切。 由圖3可知，豬PBD-124基因存在3種基因型：GG(700 bp)、GA(700/500/200 bp)和AA(500/200 bp)，該基因CDS區第257 bp處存在突變c.257G>A，引起了BlnⅠ限制性核酸內切酶的存在與丟失。

M，DL2000 DNA Marker；D1、D2，大白豬PBD-124基因PCR擴增產物；M1、M2，民豬PBD-124基因PCR擴增產物；WI，野雜豬PBD-124基因PCR擴增產物M，DL2000 DNA Marker；D1 and D2，PCR amplification products of PBD-124 gene in Large White pigs；M1 and M2,PCR amplification products of PBD-124 gene in Min pigs;W1,PCR amplification products of PBD-124 gene in wild hybrid pigs圖1 不同品種豬PBD-124基因PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification of PBD-124 gene from different pig populations

M，DL2000 Plus DNA Marker；1～4，PBD-124基因PCR擴增產物M，DL2000 Plus DNA Marker；1-4，PCR amplification products of PBD-124 gene圖2 豬PBD-124基因PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of PBD-124 gene in pigs

M，DL2000 Plus DNA Marker；1、9、11、12、16、18-24，AA基因型；3、4、13，GG基因型；2、5～8、10、14、15、17，AG基因型M，DL2000 Plus DNA Marker；1,9,11,12,16 and 18-24，AA genotype；3,4 and 13，GG genotype；2,5-8,10，14 ，15 and 17，AG genotype圖3 PBD-124基因Bln Ⅰ酶切結果Fig.3 Results of PBD-124 gene digested with Bln Ⅰ

2.3 遺傳多樣性分析

對96頭豬做PCR-RFLP酶切，統計分析各個品種豬的基因型頻率和等位基因頻率，結果見表2。由表2可知，大白豬群體中檢測出AA、AG和GG 3種基因型，基因型頻率分別為0.5161、0.3256和0.1613；而民豬和野雜豬群體中僅檢測出AA和AG 2種基因型，基因型頻率分別為0.9412、0.6542和0.0588、0.3548。3個品種中優勢等位基因均為A，該位點均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。3個群體中AA、AG和GG的總基因型頻率分別為0.698、 0.400和0.520，經卡方檢驗計算，按自由度=2，查表得知該位點在總群體中符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，達到了遺傳平衡。

由表3可知，在3個品種中大白豬的遺傳雜合度、有效等位基因數及多態信息含量均高于民豬和野雜豬，處于中度多態(0.25

表2 PBD-124基因Bln Ⅰ酶切位點的基因型頻率和基因頻率

表3 豬PBD-124基因的遺傳多樣性指標

2.4 PBD-124基因在不同品種豬不同組織中的相對表達量

由表4可知，PBD-124基因在大白豬血液中的表達量顯著高于肝臟和脾臟(P<0.05)，肝臟中的表達量略高于脾臟，但差異不顯著(P>0.05)；在民豬和野雜豬不同組織間PBD-124基因表達量均存在顯著差異(P<0.05)。PBD-124基因在民豬脾臟中的表達量顯著高于大白豬和野雜豬(P<0.05),野雜豬的表達量略高于大白豬，但差異不顯著(P>0.05)；在3個品種豬肝臟中的表達量存在顯著差異(P<0.05)；在大白豬血液中的表達量顯著高于民豬和野雜豬(P<0.05)，在民豬中的表達量高于野雜豬，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 PBD-124基因在3個品種豬各組織中的相對表達量

3 討 論

研究表明，AMPs作為機體抵御外源微生物的第一道防線，廣泛分布于細菌、真菌、植物、昆蟲、兩棲類及脊椎動物中[12]。防御素家族作為一類重要的AMPs，在哺乳動物中最為豐富，研究也較為透徹，其中β-防御素分布最廣，在所有脊椎動物中均有發現，α-防御素則存在于大部分哺乳動物中，而θ-防御素只存在于靈長類動物中。目前，在人基因組中已發現6種α-防御素和39種β-防御素[8]；在牛和豬基因組中發現了至少57和31個編碼β-防御素的基因[9]；在雞基因組中含有14種β-防御素，未發現α-防御素基因，說明不同物種防御素基因在天然免疫系統構建中的作用不盡相同。本試驗通過RT-PCR方法成功獲得豬PBD-124基因CDS序列，并證實不同遺傳背景群體不同組織中該基因表達量存在差異，為進一步研究其功能及在豬抗病表型中的作用奠定基礎。

目前，在豬基因組中所預測的β-防御素基因家族成員眾多，僅有少部分基因結構功能得到驗證。本實驗室前期參照GenBank數據庫中預測序列設計擴增引物，嘗試從外周血、肝臟和脾臟組織中檢測β-防御素基因表達，結果顯示，只有包括PBD-124基因在內的防御素基因表達，證實β-防御素家族基因存在組織器官表達特異性(未發表)。哺乳動物中β-防御素基因高度保守，目前鮮有在基因編碼區檢測到SNP位點的報道。本試驗在PBD-124基因CDS區發現2個SNPs位點，盡管未引起氨基酸位點改變，但其在不同品種群體中存在不同頻率的遺傳多樣性，且遵循Hardy-Weinberg平衡定律，說明該SNP位點并未受到較強的選擇壓力。研究表明，機體受到多種病原感染或病理條件下可激活防御素基因表達。本試驗中，3個品種豬的脾臟、肝臟和血液中均有PBD-124基因的表達且表達量各不相同，提示其可能參與黏膜和全身免疫構建[13]。血常規和抗體滴度檢測證實野雜豬、民豬較大白豬具有更強的抵抗能力[14-15]，3個群體豬PBD-124基因表達模式存在一定差異，可能是3個群體豬所處外界環境不同所引起的，或者主要由于遺傳差異所決定，仍有待于進一步研究。

盡管β-防御素存在結構功能的高度保守性，但越來越多的研究證實，β-防御素存在抗菌[16]、抗寄生蟲[17]、抗病毒、抗炎[18]及調節免疫等多種功能，因其抗菌的廣譜性和低耐藥性，使其成為具有潛在應用價值的抗生素替代品[19]。挖掘出包括β-防御素在內的具有廣譜高效抗菌活性的AMPs類物質，對提高豬群健康水平具有重要的意義，也是未來重要的研究方向。研究表明，不同品種豬自身免疫與抗菌能力也有所差異。本試驗中，脾臟、肝臟和血液中PBD-124基因表達趨勢在3個品種豬中各不相同，這與劉艷光等[20-21]研究結果相似，但具體原因尚不明確。在民豬和野雜豬免疫器官脾臟和肝臟中PBD-124基因的表達量多于大白豬，這可能與民豬和野雜豬比大白豬具有更強的抗逆能力有關。本試驗進一步證實了防御素廣泛分布在哺乳動物全身的各個器官組織中[8]，對于抵抗外界病原體、調節自身免疫、促進生長發育有一定功能[22]。抗生素的大量使用加劇了潛在的全球公共衛生危機[23]。為了減少抗菌素耐藥性的出現，需采取措施減少動物生產中抗生素的使用。AMPs存在于各種生命形式中，并在先天免疫系統中起關鍵作用，由于其抵抗病原體和微生物的能力，已被開發為維持腸道健康和減少抗生素使用的新戰略[24]。本試驗結果可為研究PBD-124基因在豬β-防御素先天免疫系統中的作用，以及為進一步完善AMPs作為抗生素替代品的抗菌、抗病毒作用提供參考。

4 結 論

本試驗成功克隆豬PBD-124基因CDS區，發現c.257 G>A和c.263 T>G 2個突變位點，因2個突變位點間隔過近，可能存在連鎖，僅對第1個突變位點進行酶切；PCR-RFLP酶切發現大白豬中存在GG、GA、AA 3種基因型，而民豬和野雜豬僅檢測到GA和AA 2種基因型；3個品種豬的脾臟、肝臟和血液中均有PBD-124基因的表達且存在表達差異，提示該基因可能參與機體先天免疫功能的構建。