三種藥物在兔外傷性增生性玻璃體視網膜病變中的作用

吳靈丹，陳 潔，王資懿，徐柒華

0引言

外傷性增生性玻璃體視網膜病變(traumatic proliferative vitreoretinopathy，TPVR)是開放性眼外傷的一種常見并發癥，其本質是過度的眼內創傷修復反應，在視網膜前后形成具有收縮能力的纖維膜，最終牽拉視網膜造成視網膜脫離，目前臨床上無有效的抑制方法。手術可以去除增生的組織，但是不能抑制細胞增殖，導致治療后復發率高[1-2]。目前臨床和基礎研究中已有多種藥物被用于治療TPVR，如皮質類固醇、抗代謝類藥物、維生素、中藥提取物等。曲安奈德(triamcinolone acetonide，TA)作為臨床上抑制TPVR發展的藥物已得到廣泛認可，但臨床使用中發現玻璃體腔注射TA后容易導致眼壓升高及白內障等不良反應[3]。最新研究表明中藥提取物青蒿琥酯(artesunate，ART)具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗增殖作用[4-7]。另有研究發現，木犀草素(luteolin，LU)與一些免疫調節和抗炎作用有關，可抑制炎性細胞活化、炎癥介質及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)生成[8]，其在眼科具有抗氧化，保護視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞及抗腫瘤作用[9-10]，可作為治療眼部疾病的一種潛在選擇。尋找能夠有效防治TPVR且對眼部毒性作用較小的藥物尤為重要，因此本研究主要觀察上述三種藥物在防治TPVR中的作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康成年青紫藍兔48只，6～8周齡，體質量2.0～2.5kg，飼養環境室溫10℃～25℃，濕度50%～75%。實驗前均行雙眼裂隙燈及直接檢眼鏡檢查，保證雙眼無眼部疾病。本研究經南昌大學附屬眼科醫院醫學研究倫理委員會審核批準(審批號：YLP202103005)。

1.1.2主要試劑和儀器曲安奈德1mg/mL(H20033525，浙江仙琚制藥股份有限公司)，木犀草素10μg/mL(MUST-18102605，成都曼特斯生物科技有限公司)，青蒿琥酯20μg/mL(418A024，北京索萊寶科技有限公司)，鹽酸丙美卡因滴眼液(愛爾康有限公司)，加替沙星眼用凝膠(沈陽興齊眼藥股份有限公司)，左氧氟沙星滴眼液(萬漢制藥有限公司)，氟米龍滴眼液(參天制藥有限公司)，蛋白酶抑制劑(士德生物工程有限公司)，PBS(美國Hyclone公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)，SDS裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)，蛋白酶抑制劑混合物(北京普利萊基因技術有限公司)，α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(西格瑪奧德里奇貿易有限公司)，波形蛋白(vimentin，VIM)(西格瑪奧德里奇貿易有限公司)，GAPDH(諾倫生物科技有限公司)，二抗Goat Anti-Rabbit IgG(武漢博士德生物工程有限公司)，PVDF膜(美國Promega公司)，免疫印跡檢測試劑盒(美國Advan-sta公司)，眼球固定液(G1109，Servicebio)。眼底照相機(尼德克醫療器械貿易有限公司)，眼部B超機(德國Aviso公司)。

1.2方法

1.2.1富含血小板的血漿制備以注射器抽取兔耳動脈血5mL注入含3.8%枸櫞酸鈉的玻璃離心管(血與枸櫞酸鈉體積比9∶1)，輕輕搖動混勻，室溫離心10min(1500r/min)，取1/3體積上清液，進行血小板計數，獲得血小板密度(1.9～2.8)×108/mL的血漿[11]。

1.2.2TPVR動物模型制作及分組將48只青紫藍兔隨機分為對照組、TA組、ART組、LU組，每組12只，均以右眼為實驗眼。術前3d，術眼滴左氧氟沙星滴眼液，每天4次。用鹽酸丙美卡因滴眼液進行表面麻醉，開瞼器開瞼，聚維酮碘注射液沖洗術眼結膜囊，采用15度刀刺向玻璃體中心部，造成長約3mm的鞏膜穿通傷，抽吸0.3mL玻璃體液后注入等量富含血小板的血漿，隨后對照組玻璃體腔內注射0.1mL生理鹽水，TA組玻璃體腔內注射0.1mL(1mg/mL)曲安奈德，ART組玻璃體腔內注射0.1mL(20μg/mL)青蒿琥酯，LU組玻璃體腔內注射0.1mL(10μg/mL)木犀草素。玻璃體腔注藥后1wk內，給予左氧氟沙星滴眼液及氟米龍滴眼液預防感染。本研究藥物注射濃度參考既往文獻[8，12-13]中的實驗數據。

1.2.3玻璃體及視網膜觀察術后1、2、3、4wk，復方托吡卡胺散瞳后，通過眼底照相、眼部B超觀察并記錄各組兔眼玻璃體及視網膜改變情況。TPVR分級評定標準[14]：(1)0級：玻璃體基本透明，未見明顯異常；(2)1級：玻璃體內形成增生條索，未見牽引；(3)2級：視網膜前可見膜狀物形成，可見局部牽引，未見視網膜脫離；(4)3級：后極部視網膜可見褶皺，可有局部視網膜脫離；(5)4級：大范圍視網膜脫離(包括后極部、周圍視網膜脫離)；(6)5級：視網膜皺縮，增生條索牽拉視網膜脫離，可見裂孔。

1.2.4WesternBlot法檢測玻璃體液中α-SMA及VIM蛋白表達水平術后28d，各組隨機選取動物4只。于角膜緣后4mm處不同鐘點位用7號針頭抽取玻璃體液0.5mL，加入蛋白酶抑制劑，12000r/min離心15min，收集上清液，BCA法檢測蛋白濃度。等量蛋白質經10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶在TBST中室溫封膜1h，并與α-SMA、VIM、GAPDH一抗混合后4℃孵育過夜；相應二抗室溫下孵育1h；滴加ECL發光液，成像系統顯影后使用Image J成像軟件分析檢測結果。實驗重復3次。

1.2.5視網膜組織HE染色術后28d，各組動物經心內注射麻醉劑“安樂死”，立即摘除右眼眼球，置于FSA眼球固定液固定，梯度蔗糖溶液脫水，OCT包埋、冰凍、切片、HE染色，顯微鏡觀察視網膜組織結構。

2結果

2.1玻璃體及視網膜改變情況術后28d，四組間TPVR分級差異有統計學意義(H=18.85，P<0.001，表1)，TA組、LU組、ART組分別與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，TA組分別與ART組、LU組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，表明TA、ART、LU均能有效抑制TPVR的發生。眼底照相及眼部B超結果顯示，對照組可見視網膜前增殖膜及視網膜脫離；LU組玻璃體混濁，視網膜前膜狀物形成，局部牽引；ART組玻璃體內增生條索，未出現牽拉性視網膜脫離；TA組未見增殖膜及視網膜脫離，僅出現玻璃體混濁(圖1～2)。

表1 術后28d各組TPVR分級情況 眼

圖1 眼底照相 A：術前正常兔眼眼底圖像；B、C：術后28d對照組兔眼視網膜脫離及增殖膜形成；D：術后28d LU組兔眼視網膜前膜狀物，髓線抬高；E：術后28d ART組兔眼玻璃體混濁，可見增生條索；F：術后28d TA組兔眼未見增殖膜，僅出現玻璃體混濁。

圖2 眼部B超 A：術前正常兔眼部B超；B：術后28d對照組兔眼玻璃體混濁伴視網膜漏斗狀脫離；C：術后28d LU組兔眼玻璃體混濁伴后脫離；D：術后28d ART組兔眼玻璃體混濁伴輕微后脫離；E：術后28d TA組兔眼玻璃體輕度混濁。

2.2玻璃體液中α-SMA及VIM蛋白表達水平Western Blot結果顯示，術后28d四組兔眼玻璃體液中α-SMA和VIM蛋白表達水平差異均有統計學意義(P<0.001，表2，圖3)。TA組、LU組和ART組玻璃體液中α-SMA和VIM蛋白表達水平均低于對照組，LU組和ART組玻璃體液中α-SMA和VIM蛋白表達水平均高于TA組，ART組玻璃體液中α-SMA和VIM蛋白表達水平均低于LU組，差異均有統計學意義(P<0.01)。

表2 各組玻璃體液α-SMA及VIM蛋白水平比較

圖3 各組玻璃體液中α-SMA、VIM蛋白表達水平 A：Western Blot檢測結果；B：四組玻璃體液α-SMA蛋白表達水平比較；C：四組玻璃體液VIM蛋白表達水平比較。bP<0.01 vs 對照組；dP<0.01 vs TA組；fP<0.01 vs ART組。

2.3視網膜組織HE染色結果術后28d，對照組兔眼視網膜各層排列紊亂，嚴重扭曲或局部斷裂，各層結構不清晰，前膜明顯增厚，視網膜明顯脫離；LU組兔眼視網膜各層排列輕微扭曲，視網膜前可見炎性滲出，視網膜淺層脫離；ART組兔眼視網膜結構清晰，輕度水腫，可見淺層脫離；TA組兔眼視網膜各層結構清晰，排列尚整齊，局部可見視網膜褶皺，無視網膜脫離(圖4)。

圖4 術后28d視網膜病理變化 A：對照組結構紊亂，嚴重扭曲，視網膜脫離；B：TA組結構基本整齊正常，視網膜水腫；C：LU組視網膜前炎性滲出及視網膜淺層脫離；D：ART組視網膜結構紊亂，輕度水腫，視網膜淺層脫離。

3討論

TPVR的形成過程是復雜的循環鏈式反應，是由多種因子及細胞作用的結果。眼外傷導致玻璃體和視網膜破裂，使得RPE細胞從Bruch膜中脫離。RPE作為TPVR的主要參與者，RPE細胞經歷了上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的過程，同時巨噬細胞、成纖維細胞、神經膠質細胞等遷入，并在各種細胞因子、血小板衍生因子(platelet derived growth factor，PDGF)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、VEGF等作用下產生間充質細胞等生物學效應，形成具有收縮作用的前膜，最終導致視網膜脫離[15-17]。本研究顯示，TA、ART、LU均能通過抑制玻璃體液中α-SMA及VIM表達顯著抑制玻璃體視網膜增生，表明TA、ART、LU均可有效抑制TPVR的發生發展，由此推測上述藥物均參與延緩EMT進程，有望成為治療TPVR的新方法。

既往研究表明玻璃體腔注射TA可以明顯減少增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的發生[12]。TA可降低細胞免疫反應，對血-視網膜屏障起穩定作用，減輕炎癥，抑制磷脂酶、前列腺素、白三烯等炎癥因子的生成或釋放，阻止炎癥細胞移行[18]，且可抑制成纖維細胞分化、色素上皮細胞增殖、巨噬細胞和肥大細胞移行，具有抗增殖和抑制瘢痕形成的作用。α-SMA及VIM作為間充質細胞的間質標志物，已經被證實在PVR的形成過程中表達增加[19-20]。研究表明，諸多藥物能夠通過降低α-SMA及VIM的表達水平抑制RPE細胞的增殖，從而阻斷EMT過程，能夠顯著緩解PVR的發生。白藜蘆醇通過抑制SAMD4通路抑制經TGF-β2誘導的RPE細胞的EMT過程，且能降低α-SMA的表達，表明其能抑制TPVR的發生發展[21]；姜黃素可通過多種途徑抑制RPE細胞的增殖和EMT過程[22]；藏紅花素通過抑制p38的磷酸化降低VIM和α-SMA的表達，表明其能夠有效抑制RPE細胞增殖、遷移和TGF-β2誘導的EMT過程[23]。上述中藥提取物均可以通過抑制不同的信號通路抑制RPE細胞的增殖和遷移。

本研究發現，三組注藥組玻璃體液中α-SMA及VIM蛋白含量均低于對照組，表明TA、ART、LU可能參與調控RPE細胞的EMT過程，抑制TPVR的產生。此外，玻璃體腔注射TA術后28d眼部B超顯示僅有玻璃體輕度混濁；眼底圖像未見增殖膜；TPVR分級明顯低于對照組；病理切片顯示視網膜各層結構清晰，排列尚整齊，僅出現視網膜水腫，表明TA可以抑制TPVR前膜的發生以及降低玻璃體液中α-SMA及VIM的表達，且效果優于ART和LU，提示TA對EMT過程具有更強的調控作用，這與王兆艷等[24]報道相似。但是，由于TA在臨床中具有較多的不良反應報道，不利于其廣泛應用。為尋更優于TA的藥物，本研究選擇ART和LU進行研究，ART和LU雖未見于在TPVR臨床治療中的應用，但本研究發現玻璃體腔注射ART及LU術后28d眼部B超及眼底圖像顯示玻璃體混濁，出現玻璃體增生條索及膜性物質；TPVR分級低于對照組；病理切片結構也較對照組清晰，提示ART和LU也能在一定程度上抑制α-SMA及VIM的表達，且顯著抑制TPVR癥狀。近期也有研究證明，ART能夠通過Smad3信號通路抑制ARPE-19細胞的增殖和收縮，從而抑制α-SMA及VIM的表達[25]，這與本研究結果相符。另有研究表明ART能抑制眼內新生血管[26-27]，抑制人卵巢癌細胞增殖以及通過抑制TGF-β1介導的肺泡上皮NF-κB及成纖維細胞的信號通路Jagged1、Notch1，從而抑制α-SMA及膠原的表達[28]。LU可通過抑制炎癥標志物的表達和釋放減輕眼部炎癥，且與皮質類固醇抗炎效果相當[29]，且有學者證實LU可以保護視網膜神經節細胞及RPE細胞[29-31]。李茜等[32]研究發現LU可以通過抑制大鼠NF-κB信號通路減輕視網膜組織氧化應激及炎癥損傷，而Jagged1、Notch1、NF-κB信號通路也參與TGF-β2介導的RPE細胞EMT過程。故推測ART、LU能通過抑制多種信號通路進一步抑制TPVR的產生，其在TPVR治療中具有極大的潛在應用價值，但具體作用機制有待于進一步探索，未來研究中可以通過深入研究ART及LU對RPE細胞的作用揭示其抗TPVR發生的機制。

綜上，玻璃體腔內注射TA、LU及ART均對TPVR具有抑制作用，其中TA效果最明顯。ART和LU是潛在的有效藥物，但是作用機制尚不明確，后期可通過研究具體的作用機制為開發抗增殖效果明顯且毒副作用小的TPVR防治藥物奠定基礎。