小鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中TLR-9與MyD88表達變化

李雪穎，李 迪，陳麗平，李 靜

0引言

外傷性視神經(jīng)病變是常見的臨床問題，研究發(fā)現(xiàn)閉合性顱腦外傷的患者中有0.5%～5%伴隨有視神經(jīng)損傷[1]。如發(fā)生顱面部骨折，視神經(jīng)損傷(optic nerve injury，ONI)的發(fā)生率上升為10%[2]。目前對于外傷性視神經(jīng)損傷主要的治療方法還是視神經(jīng)管減壓術(shù)、糖皮質(zhì)激素治療、營養(yǎng)神經(jīng)治療及改善循環(huán)治療[3]。研究報道視神經(jīng)管減壓術(shù)治療外傷性視神經(jīng)病變的有效率為50%～60%[4-5]。而藥物、基因、干細胞移植等一些治療方法的效果也不確切。目前創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷的治療仍是臨床面臨的難題。

Toll樣受體-9(Toll like recepter 9，TLR-9)是Toll樣模式識別受體家族成員之一，是Hemmi等[5]在2000年發(fā)現(xiàn)的Tolls家族新成員，表達于免疫細胞，通過與細菌DNA作用而誘導(dǎo)機體的固有免疫反應(yīng)。髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是TLR-9和其他TLRs的銜接分子[6-7]。近年發(fā)現(xiàn)TLR-9在很多疾病進程中起重要作用，而TLR-9是否參與視神經(jīng)損傷的病理過程鮮見報道。本實驗旨在研究TLR-9及其銜接分子MyD88在視神經(jīng)損傷后的變化特點，為視神經(jīng)損傷病變的治療提供新的思路。

1材料和方法

1.1材料選取清潔級8周齡雄性C57BL/6J小鼠36只，無眼疾(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供)。動物飼養(yǎng)保持12h晝夜交替的生物節(jié)律，能自由飲用水和食物，室溫保持在20℃～24℃條件下每日定時清洗籠舍。飼養(yǎng)環(huán)境及實驗操作均符合國家科學(xué)技術(shù)委員會《實驗動物管理條例》規(guī)定，并獲得陜西省人民醫(yī)院動物倫理委員會許可。隨機分為6組每組6只：空白對照組(未做任何處理)、ONI 1d組(視神經(jīng)損傷后1d取材)、ONI 3d組(視神經(jīng)損傷后3d取材)、ONI 5d組(視神經(jīng)損傷后5d取材)、ONI 7d組(視神經(jīng)損傷后7d取材)、ONI 14d組(視神經(jīng)損傷后14d取材),分組后進行造模。

1.2方法

1.2.1視神經(jīng)損傷模型1%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，經(jīng)顳側(cè)入路顯露左側(cè)視神經(jīng),延長軸方向剪開神經(jīng)鞘,分離視神經(jīng),避免損傷視網(wǎng)膜中央動脈。于球后0.5～1mm處夾持視神經(jīng)，夾持時間為5s。手術(shù)完術(shù)眼涂紅霉素眼膏，放置于電熱毯上蘇醒。蘇醒后于動物房中正常飼養(yǎng)。1%戊巴比妥鈉腹腔注射安樂處死小鼠。模型制作成功標(biāo)準(zhǔn):傷后10min瞳孔散大,間接對光反射存在,直接對光反射消失,且眼底明確未損傷大鼠眼動脈、眼底供血情況恢復(fù)良好。30只模型鼠經(jīng)確認(rèn)均建模成功。

1.2.2RT-qPCR 視神經(jīng)損傷后1、3、5、7、14d利用RNeasy Lipid Tissue Mini Kit試劑盒(QIAGEN, Germany)從小鼠視網(wǎng)膜提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ(Invitrogen, USA)和寡核苷酸oligo-dT將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。用UNICONTM qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒(Yeasen,Shanghai,China)在StepOnePlus unit(Applied Biosystems, USA)實時熒光定量PCR儀上完成RT-qPCR檢測。方法：94℃預(yù)變性55s，然后進行一下循環(huán)：95℃變性30s，57℃退火30s，73℃延伸30s，共進行45個循環(huán)。然后再95℃變性10s，65℃退火45s，40℃延伸60s。使用2-△△Ct方法計算相對mRNA水平。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。引物序列如下:TLR-9:正向引物,5’-GCA ATG TTC TAT ATG CAT TCT C-3’,反向引物,5’-TGA TAT TGG CAC ACC AAC AC-3’;MyD88:正向引物,5’-AGG GTC GCA CAG TGG GTG A-3’,反向引物,5’-CGT GTT CTC TTG CGC ATT CC-3’。

1.2.3Western-blot 視網(wǎng)膜組織在lysis buffer(Roche Biochemicals, USA)緩沖液中裂解。Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, USA)蛋白質(zhì)分析試劑盒測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE(Invitrogen)分離等量的蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF, Millipore, USA)膜中。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1.5h后，將膜與一抗TLR-9(ab134368)(以1∶1000稀釋)、一抗MyD88(ab219413)(以1∶1000稀釋)和GAPDH(ab9485)(以1∶1000稀釋)在4℃下孵育過夜，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗山羊抗小鼠IgG(Bio-Rad,USA)(以1∶1000稀釋)或二抗山羊抗兔IgG(Bio-Rad)(以1∶1000稀釋)在常溫下孵育1.5h。用增強的化學(xué)發(fā)光試劑檢測蛋白條帶，并用Image J系統(tǒng)定量。GAPDH為內(nèi)參。

2結(jié)果

2.1各組小鼠視網(wǎng)膜中TLR-9mRNA和TLR-9蛋白表達變化情況各組小鼠視網(wǎng)膜中TLR-9 mRNA的表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=560.1，P<0.0001)，見表1。RT-qPCR結(jié)果見圖1。ONI 1d組視網(wǎng)膜中TLR-9 mRNA的表達量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ONI 3d、ONI 5d、ONI 7d、ONI 14d組視網(wǎng)膜中TLR-9 mRNA的表達量與空白對照組比較明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各組小鼠視網(wǎng)膜中TLR-9蛋白的表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=305.5，P<0.0001)，見表1。Western-blot結(jié)果見圖2。ONI 1d組視網(wǎng)膜中TLR-9蛋白的表達量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ONI 3d、ONI 5d、ONI 7d、ONI 14d組視網(wǎng)膜中TLR-9蛋白的表達量與空白對照組比較明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。TLR-9 mRNA和TLR-9蛋白的變化規(guī)律為ONI 3d表達開始升高，ONI 5d達到頂峰，ONI 7d表達開始下降，ONI 14d表達依然高于空白對照組。

圖1 RT-qPCR檢測各組小鼠視神經(jīng)損傷后TLR-9 mRNA的表達情況 bP<0.01 vs 空白對照組。

表1 各組小鼠視網(wǎng)膜中TLR-9和MyD88的表達情況

圖2 Western-blot檢測小鼠視神經(jīng)損傷后TLR-9蛋白的表達情況 bP<0.01 vs 空白對照組。

2.2各組小鼠視網(wǎng)膜中MyD88mRNA和MyD88蛋白表達變化情況各組小鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中MyD88 mRNA的表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=439.3，P<0.0001)，見表1。RT-qPCR結(jié)果見圖3。ONI 1d組視網(wǎng)膜中MyD88 mRNA的表達量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ONI 3d、ONI 5d、ONI 7d、ONI 14d組視網(wǎng)膜中MyD88 mRNA的表達量與空白對照組比較均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。各組小鼠視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中MyD88蛋白的表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=422.6，P<0.0001)，見表1。Western-blot結(jié)果見圖4，ONI 1d組視網(wǎng)膜中MyD88蛋白的表達量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；ONI 3d、ONI 5d、ONI 7d、ONI 14d組視網(wǎng)膜中MyD88蛋白的表達量與空白圖3RT-qPCR檢測小鼠視神經(jīng)損傷后MyD88mRNA的表達情況bP<0.01vs空白對照組。

對照組比較均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。MyD88 mRNA和MyD88蛋白的變化規(guī)律為ONI 3d表達開始升高，ONI 5d達到頂峰，ONI 7d表達開始下降，ONI 14d表達依然高于空白對照組。

3討論

視神經(jīng)是中樞神經(jīng)的一部分，是將視覺信息從眼部傳輸?shù)酱竽X的重要結(jié)構(gòu)，視神經(jīng)損傷后會激活多種繼發(fā)性損傷機制，從而導(dǎo)致不可逆的視力損傷[8]。臨床對于視神經(jīng)損傷的治療主要有手術(shù)治療和藥物，手術(shù)的有效率在一半左右，而藥物治療的療效也不確定，能不能有更好的治療方法來挽救視神經(jīng)損傷患者的視力仍是我們要迫切解決的問題。

Toll樣受體(TLRs)家族是一類重要的表面模式識別受體，其信號通路是介導(dǎo)免疫細胞產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答的極為重要的機制。人類TLR家族已發(fā)現(xiàn)10個成員(TLR1～10)，可分為兩類：表達于細胞膜上和表達于胞內(nèi)細胞器膜上。TLR-9表達于細胞器膜上，主要識別細胞質(zhì)中的病毒或細菌[9]。TLRs可以在多種疾病中參與炎癥反應(yīng)的過程[10-12]。有研究發(fā)現(xiàn)阻斷TLR介導(dǎo)的MyD88依賴的MAPK信號通路能夠減輕顆粒物誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)TLR-9的缺乏會加重一些自身免疫性疾病的病情。有研究發(fā)現(xiàn)狼瘡傾向的Sle1小鼠與TLR-9缺乏的鼠雜交形成Sle1TLR-9小鼠，小鼠病情比Slel小鼠更加嚴(yán)重[14]。TLR-9在眼科相關(guān)疾病的研究少見報道，我們的研究發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜中的TLR-9 mRNA和TLR-9蛋白水平都顯著增加，與空白對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義，這提示TLR-9可能在視神經(jīng)損傷的病程中起重要作用。但是它對疾病的發(fā)展起到的是正向的作用還是負(fù)向的作用還有待我們進一步研究。

圖4 Western-blot檢測大鼠視神經(jīng)損傷后MyD88蛋白的表達情況 bP<0.01 vs 空白對照組。

有研究發(fā)現(xiàn)，眶內(nèi)視神經(jīng)損傷后5～6d視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞開始不可逆的凋亡[15]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)了視神經(jīng)損傷后TLR-9在視網(wǎng)膜中表達變化的規(guī)律，TLR-9的表達在視神經(jīng)損傷后3d開始升高，損傷后5d達到頂峰，損傷后7d表達開始下降，TLR-9的表達早于神經(jīng)節(jié)細胞開始凋亡的時間，TLR-9的升高可能與神經(jīng)節(jié)細胞的凋亡有關(guān)。這也為我們后續(xù)的研究提供的一定的實驗基礎(chǔ)，也為治療干預(yù)的時間窗選擇提供了依據(jù)。

MyD88基因主要表達于免疫細胞中，最初在髓樣細胞的分化過程中被發(fā)現(xiàn)，是細胞質(zhì)中的一種可溶性蛋白。MyD88是細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵銜接蛋白，能夠介導(dǎo)多種Toll樣受體(TLRs)、白細胞介素1受體(IL-1R)及白細胞介素-18受體(IL-18R)的信號傳遞，在固有免疫中擔(dān)任重要角色[16]。研究發(fā)現(xiàn)大鼠視神經(jīng)損傷后TLR-4與MyD88表達增加，脂肪干細胞移植能夠降低視神經(jīng)損傷大鼠TLR-4與MyD88表達，改善大鼠的視功能[17]。Syeda等[18]對MyD88基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比基因敲除組促炎性細胞因子分泌顯著減少，激活的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少、聚集減弱，視網(wǎng)膜光感受器細胞的凋亡壞死明顯減少。我們的研究發(fā)現(xiàn)小鼠視神經(jīng)損傷后MyD88的表達變化規(guī)律與TLR-9的表達變化規(guī)律是一致的，這也證明TLR-9/MyD88信號通路與小鼠視神經(jīng)損傷進程的相關(guān)性。MyD88激動劑和抑制劑可以調(diào)節(jié)MyD88的表達，從而在疾病中起到治療的作用。

視神經(jīng)損傷的治療是臨床的難題，我們的研究發(fā)現(xiàn)TLR-9和MyD88可能是視神經(jīng)損傷疾病病程進展過程的重要影響因素，調(diào)節(jié)TLR-9和MyD88的表達可能成這類疾病治療的一個靶點。