沉默LncRNA DLGAP1-AS2對人視網膜母細胞瘤增殖和遷移及侵襲的影響

李 暉，汪明紅，廖風玲，劉國立

0引言

視網膜母細胞瘤是臨床常見的一種惡性腫瘤且已嚴重威脅患者生命安全，目前視網膜母細胞瘤的發病機制尚未闡明，研究表明長鏈非編碼RNA(LncRNA)表達異常與視網膜母細胞瘤發生及發展密切相關，并可能作為視網膜母細胞瘤診斷及治療的潛在靶點[1-4]。LncRNA DLGAP1-AS2在膽管癌中呈高表達，并可促進膽管癌細胞增殖、遷移及侵襲[5]。但DLGAP1-AS2與視網膜母細胞瘤相關研究報道相對較少。Starbase預測顯示DLGAP1-AS2與miR-1193存在結合位點，研究表明miR-1193上調表達可抑制宮頸癌細胞增殖及轉移[6]。但DLGAP1-AS2與miR-1193在視網膜母細胞瘤發生及發展過程中的作用機制尚未可知。因此，本研究主要探討DLGAP1-AS2是否可通過靶向調控miR-1193表達而調節人視網膜母細胞瘤HXO-Rb44增殖、遷移和侵襲。

1材料和方法

1.1材料收集病理確診且臨床資料完整的視網膜母細胞瘤組織標本25例，其中男15例，女10例，年齡8月齡～10歲(平均5.68±1.25歲)。同時選取因外傷摘除眼球的正常視網膜組織9例為對照，其中男5例，女4例，年齡9月齡～10歲(平均5.22±1.16歲)。兩組研究對象年齡、性別比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過醫院倫理委員會審核。

人正常視網膜血管內皮細胞ACBRI-181、視網膜母細胞瘤HXO-Rb44購自美國ATCC；DMEM培養液與胎牛血清購自美國Gibco；Trizol試劑購自美國Thermo Fisher；cDNA合成及qRT-PCR試劑及引物購自大連寶生物；Lipofectamine 2000、Transwell小室、Matrigel基質膠購自北京索萊寶；CCK-8試劑購自上海碧云天生物；DLGAP1-AS2小分子干擾RNA(si-DLGAP1-AS2)及其陰性對照(si-NC)、miR-1193寡核苷酸模擬物(miR-1193 mimic)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-1193寡核苷酸抑制物(miR-1193 inhibitor)購自廣州銳博生物；兔抗人E-cadherin、N-cadherin抗體與二抗購自美國CST。

1.2方法

1.2.1石蠟切片HE染色將烤好的組織切片置于新鮮二甲苯中脫蠟10min×3次；依次放入體積分數100%、95%、85%、70%乙醇中各3～5min后蒸餾水沖洗；Harry蘇木素染液染色8min，蒸餾水沖洗；體積分數1%鹽酸酒精分色，蒸餾水沖洗，自來水沖洗20min返藍；伊紅染液染色1min，蒸餾水沖洗；依次經體積分數95%、100%乙醇浸泡脫水各2次，每次20s，干燥后依次置于酒精二甲苯溶液、兩缸二甲苯中各5min；迅速滴加適量中性樹膠，蓋玻片封固;顯微鏡下觀察、照相。

1.2.2實驗分組ACBRI-181細胞、HXO-Rb44細胞培養于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素與100μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，于37℃、5% CO2體積分數培養箱內培養，待細胞生長至80%融合度時進行傳代培養。取對數生長期HXO-Rb44細胞接種于96孔板(3×103個/孔)，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行操作。將si-DLGAP1-AS2 A、si-DLGAP1-AS2 B、si-DLGAP1-AS2 C分別轉染至HXO-Rb44細胞，分別記為si-DLGAP1-AS2 A組、si-DLGAP1-AS2 B組、si-DLGAP1-AS2 C組，采用qRT-PCR法檢測細胞中DLGAP1-AS2表達量，選取干擾效果較好的進行后續實驗。將si-NC、si-DLGAP1-AS2、miR-NC、miR-1193 mimic、si-DLGAP1-AS2與miR-1193 inhibitor(共轉染)分別轉染至HXO-Rb44細胞，分別記為si-NC組、si-DLGAP1-AS2組、miR-NC組、miR-1193 mimic組、si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組。同時將正常培養的HXO-Rb44細胞記為control組。

1.2.3qRT-PCR檢測DLGAP1-AS2和miR-1193的表達水平用Trizol試劑分別提取正常視網膜組織、視網膜母細胞瘤組織、ACBRI-181細胞、HXO-Rb44細胞與轉染后各組HXO-Rb44細胞總RNA，應用紫外分光光度計測定RNA濃度。反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，反應條件：95℃預變性5min循環1次，95℃變性15s，60℃退火60s，72℃延伸30s，共循環40次。應用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測DLGAP1-AS2、miR-1193相對表達量。

1.2.4雙熒光素酶報告實驗檢測DLGAP1-AS2與miR-1193的靶向關系由美國Promega公司構建含有DLGAP1-AS2與miR-1193互補序列的野生型報告基因載體WT-DLGAP1-AS2和含有突變序列的突變型報告基因載體MUT-DLGAP1-AS2，用脂質體轉染法將miR-NC/WT-DLGAP1-AS2、miR-NC/MUT-DLGAP1-AS2、miR-1193 mimic/WT-DLGAP1-AS2、miR-1193 mimic/MUT-DLGAP1-AS2分別共轉染至HXO-Rb44細胞，加入20μL 1×Passive Lysis Buffer，加入100μL Luciferase Assay Reagent Ⅱ，于熒光發光儀檢測Firefly Luciferase活性值，加入100μL Stop&Glo Reagent于熒光發光儀檢測Renilla Luciferase活性值，以海腎熒光素酶報告基因活性值為內參，計算各組細胞熒光素酶活性值。

1.2.5CCK-8實驗檢測細胞增殖取各組HXO-Rb44細胞接種于96孔板(4×103個/孔)，每孔加入10μL CCK-8溶液，于37℃培養箱培養2h，用酶標儀檢測各孔光密度值(OD 450nm)并計算細胞增殖抑制率[(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%]。

1.2.6平板克隆形成實驗取各組HXO-Rb44細胞接種于6孔板(500個/孔)，于37℃培養箱培養14d，每隔2d更換一次培養液，4%多聚甲醛固定20min(-20℃)，1%結晶紫染色15min，PBS洗滌后晾干，觀察集落形成數。

1.2.7Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲遷移實驗：取各組HXO-Rb44細胞(1×105cell/mL)按照每孔200μL的密度加入小室的上室，按照每孔600μL的密度將含有10%胎牛血清的培養液加入下室，37℃培養箱內培養24h，多聚甲醛固定20min，用0.1%結晶紫染液染色20min，顯微鏡下觀察遷移細胞數。侵襲實驗：Matrigel基質膠稀釋液按照每孔40μL的密度加入小室的上室，37℃培養箱內固定5h，后續實驗步驟同遷移實驗。

1.2.8Westernblot檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達量各組HXO-Rb44細胞加入500μL RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經SDS-PAGE凝膠電泳、電轉膜至PVDF膜，密封2h，加入E-cadherin(1∶500)、N-cadherin(1∶500)、GAPDH抗體(1∶1000)稀釋液4℃孵育24h，TBST洗膜40min，加入二抗稀釋液(1∶3000)37℃孵育1h，TBST洗膜40min，ECL試劑與DNR BioImaging System觀察PVDF膜上蛋白條帶，用凝膠圖像處理系統軟件分析蛋白條帶灰度值。

2結果

2.1病理形態特征檢測與正常視網膜組織細胞相比，視網膜母細胞瘤組織中腫瘤細胞核大，染色較深，細胞呈橢圓或梭形，可見核分裂，排列不規則，見圖1。

2.2DLGAP1-AS2和miR-1193表達的檢測與正常視網膜組織比較，視網膜母細胞瘤組織中DLGAP1-AS2的表達量升高(P<0.05)，miR-1193的表達量降低(P<0.05)，見表1。與ACBRI-181細胞比較，HXO-Rb44細胞中DLGAP1-AS2的表達量升高(P<0.05)，miR-1193的表達量降低(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 視網膜母細胞瘤細胞HXO-Rb44中DLGAP1-AS2和miR-1193表達的檢測

圖2 視網膜母細胞瘤組織和細胞中DLGAP1-AS2和miR-1193表達的檢測 A：與正常視網膜組織相比，DLGAP1-AS2在視網膜母細胞瘤組織中高表達；B：與正常視網膜組織相比，miR-1193在視網膜母細胞瘤組織中低表達；C：與ACBRI-181細胞相比，DLGAP1-AS2在HXO-Rb44細胞中高表達；D：與ACBRI-181細胞相比，miR-1193在HXO-Rb44細胞中低表達。aP<0.05 vs 正常視網膜組織組；cP<0.05 vs ACBRI-181組。

2.3沉默DLGAP1-AS2處理后DLGAP1-AS2表達的檢測與control組、si-NC組比較，si-DLGAP1-AS2 A組、si-DLGAP1-AS2 B組、si-DLGAP1-AS2 C組DLGAP1-AS2的表達量降低(P<0.05)，見表3、圖3。其中si-DLGAP1-AS2 A組DLGAP1-AS2的表達量相對較低，因而選用si-DLGAP1-AS2 A進行后續實驗。

表3 沉默DLGAP1-AS2后DLGAP1-AS2表達的檢測

圖3 沉默DLGAP1-AS2后DLGAP1-AS2表達的檢測 1：control組；2：si-NC組；3：si-DLGAP1-AS2 A組；4：si-DLGAP1-AS2 B組；5：si-DLGAP1-AS2 C組。aP<0.05 vs control組；cP<0.05 vs si-NC組。

2.4DLGAP1-AS2和miR-1193靶向關系Starbase預測顯示DLGAP1-AS2與miR-1193存在結合位點，見圖4A。miR-1193過表達可抑制野生型載體WT-DLGAP1-AS2的熒光素酶活性(P<0.05)，而未能抑制突變型載體MUT-DLGAP1-AS2的熒光素酶活性，見表4、圖4B。

表4 雙熒光素酶報告實驗

圖4 DLGAP1-AS2和miR-1193的互補序列及熒光素酶活性檢測 A：DLGAP1-AS2和miR-1193的互補序列；B：雙熒光素酶報告實驗檢測熒光素酶活性。aP<0.05 vs miR-NC組。

2.5各個處理組對HXO-Rb44中miR-1193及增殖的影響與control組、si-NC組比較，si-DLGAP1-AS2組miR-1193的表達量升高(P<0.05)，細胞增殖抑制率升高(P<0.05)，集落形成數減少(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-1193 mimic組miR-1193的表達量升高(P<0.05)，細胞增殖抑制率升高(P<0.05)，集落形成數減少(P<0.05)；與si-DLGAP1-AS2組比較，si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組miR-1193的表達量降低(P<0.05)，細胞增殖抑制率降低(P<0.05)，集落形成數增多(P<0.05)，見表5、圖5。

表5 HXO-Rb44細胞中miR-1193、抑制率和集落形成數的檢測

圖5 HXO-Rb44細胞中miR-1193、抑制率和集落形成數的檢測 A：miR-1193表達的檢測；B：HXO-Rb44細胞抑制率的檢測；C：HXO-Rb44細胞集落形成數的檢測。1：control組；2：si-NC組；3：si-DLGAP1-AS2組；4：miR-NC組；5：miR-1193 mimic組；6：si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組。aP<0.05 vs control組；cP<0.05 vs si-NC組；eP<0.05 vs miR-NC組；gP<0.05 vs si-DLGAP1-AS2組。

2.6各個處理組對HXO-Rb44遷移和侵襲的影響與control組、si-NC組比較，si-DLGAP1-AS2組遷移及侵襲細胞數減少(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-1193 mimic組遷移及侵襲細胞數減少(P<0.05)；與si-DLGAP1-AS2組比較，si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組遷移及侵襲細胞數增多(P<0.05)，見圖6、表6。

表6 HXO-Rb44細胞遷移和侵襲的檢測 個)

圖6 HXO-Rb44細胞遷移、侵襲的檢測 1：control組；2：si-NC組；3：si-DLGAP1-AS2組；4：miR-NC組；5：miR-1193 mimic組；6：si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組。aP<0.05 vs control組；cP<0.05 vs si-NC組；eP<0.05 vs miR-NC組；gP<0.05 vs si-DLGAP1-AS2組。

2.7各個處理組對HXO-Rb44中E-cadherin和N-cadherin表達的影響與control組、si-NC組比較，si-DLGAP1-AS2組E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平降低(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-1193 mimic組E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平降低(P<0.05)；與si-DLGAP1-AS2組比較，si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05)，N-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，見圖7、表7。

圖7 E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的檢測 1：control組；2：si-NC組；3：si-DLGAP1-AS2組；4：miR-NC組；5：miR-1193 mimic組；6：si-DLGAP1-AS2+miR-1193 inhibitor組。aP<0.05 vs control組；cP<0.05 vs si-NC組；eP<0.05 vs miR-NC組；gP<0.05 vs si-DLGAP1-AS2組。

表7 HXO-Rb44中E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的檢測

3討論

LncRNA在視網膜母細胞瘤發生發展過程中可發揮重要調控作用，例如，沉默LncRNA ANRIL可通過調節miR-99a和c-Myc而抑制視網膜母細胞瘤細胞生長并促進其凋亡[7]。LncRNA XIST通過競爭性結合miR-101而促進視網膜母細胞瘤細胞轉移[8]。敲低LncRNA PVT1可抑制視網膜母細胞瘤的進展[9]。LncRNA CANT1可抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖[10]。

DLGAP1-AS2在視網膜母細胞瘤中的表達尚未可知。研究表明抑制DLGAP1-AS2表達可抑制肝癌細胞遷移及侵襲[11]。DLGAP1-AS2通過上調YAP1表達而促進神經膠質瘤的發生[12]。DLGAP1-AS2在Wilms腫瘤中表達上調，并可能作為Wilms腫瘤診斷的潛在生物學標記物[13]。本研究結果顯示，視網膜母細胞瘤組織與細胞系中DLGAP1-AS2的表達量升高，沉默DLGAP1-AS2可增高視網膜母細胞瘤細胞增殖抑制率，集落形成數減少，提示沉默DLGAP1-AS2可抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖及克隆形成。表明DLGAP1-AS2高表達可促進視網膜母細胞瘤細胞增殖及增強細胞克隆形成能力從而促進視網膜母細胞瘤的發生及發展。E-cadherin與N-cadherin表達失調可調節上皮-間質轉化(EMT)進而調控細胞轉移[14]。本研究結果顯示，沉默DLGAP1-AS2后視網膜母細胞瘤遷移及侵襲細胞數減少，E-cadherin蛋白水平升高，N-cadherin蛋白水平降低，提示沉默DLGAP1-AS2可抑制視網膜母細胞瘤細胞遷移及侵襲。表明DLGAP1-AS2高表達可促進視網膜母細胞瘤細胞遷移及侵襲從而發揮癌基因作用。

本研究證實DLGAP1-AS2可靶向結合miR-1193，并可負向調控miR-1193的表達。提示DLGAP1-AS2可能通過靶向miR-1193而促進視網膜母細胞瘤發展。研究表明miR-1193表達下調可促進皮膚鱗狀細胞癌的發展[15]。miR-1193通過直接靶向跨膜9超家族3(TM9SF3)抑制人T細胞白血病細胞增殖和侵襲[16]。抑制miR-1193表達可促進成膠質細胞瘤的發生[17]。本研究結果顯示，視網膜母細胞瘤組織與細胞系中miR-1193的表達量降低，上調miR-1193表達可抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，而抑制其表達可恢復沉默DLGAP1-AS2對視網膜母細胞瘤細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲的抑制作用。提示DLGAP1-AS2可能通過靶向miR-1193而促進視網膜母細胞瘤細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，視網膜母細胞瘤組織與細胞系中DLGAP1-AS2表達上調，而miR-1193表達下調，DLGAP1-AS2與miR-1193存在靶向調控作用，沉默DLGAP1-AS2可通過促進miR-1193表達而抑制視網膜母細胞瘤細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲，DLGAP1-AS2/miR-1193在視網膜母細胞瘤發生發展過程中可發揮重要調控作用，并可能作為視網膜母細胞瘤治療的潛在靶點，還可能為進一步揭示視網膜母細胞瘤的發病機制奠定實驗基礎。但DLGAP1-AS2基因序列上富含多個miRNA的結合位點，其是否可通過靶向調控其他miRNA而參與視網膜母細胞瘤發生及發展過程仍需進一步探究。