白細(xì)胞介素6啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性

尚耀民 胡 旭 周曉蕾 宋文斌 邢寶春

河南省胸科醫(yī)院 1 結(jié)核內(nèi)科 2 呼吸與危重癥科,河南省鄭州市 450000； 3 光山縣人民醫(yī)院呼吸與危重癥科

肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌感染肺部所致，臨床以淋巴結(jié)腫大、乏力、咯血等為主要癥狀，嚴(yán)重威脅患者身體健康[1]。多數(shù)研究認(rèn)為，肺結(jié)核的發(fā)病與宿主、病原的基因變異及環(huán)境等多因素相互作用有關(guān)，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且存在較大個(gè)體差異，推測其易感性與遺傳多態(tài)性密切相關(guān)[2]。近年來，已有部分研究表明白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)家族成員IL-12、IL-23等基因多態(tài)性與其他結(jié)核病的易感性密切相關(guān)[3]，也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6基因多態(tài)性與肺炎、肺動(dòng)脈高壓等肺部疾病的發(fā)生有關(guān)[4-5]，但關(guān)于IL-6多態(tài)性與肺結(jié)核病相關(guān)性的研究較為少見。因此，本研究通過檢測肺結(jié)核患者與正常對照者IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)-572C/G和-174G/C位點(diǎn)的基因型分布情況，探討IL-6基因多態(tài)性是否與肺結(jié)核的易感性相關(guān)，為肺結(jié)核預(yù)防工作的決策提供依據(jù)，同時(shí)也為結(jié)核病的診療研究提供一定理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年6月—2021年3月河南省胸科醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者115例作為觀察組，其中男67例，女48例，年齡21～55歲，平均年齡(35.45±6.08)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)《肺結(jié)核診斷和治療指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡18～60歲，漢族，常住河南地區(qū)；(3)痰培養(yǎng)陽性，肺部有結(jié)核樣病灶，或痰培養(yǎng)陰性，活動(dòng)性肺結(jié)核樣病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他肺部相關(guān)疾病和其他嚴(yán)重器質(zhì)性病變；(2)免疫功能異常者；(3)臨床資料不全者。同時(shí)隨機(jī)選取同期在我院體檢的健康人群101例作為對照組，其中男52例，女49例，年齡23～55歲，平均年齡(34.75±5.21)歲。以上所有受試者均為本地區(qū)漢族人群且無其他遺傳病史。本研究經(jīng)河南省胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，并且所有受試者均對本研究知情同意。

1.2 基因多態(tài)性檢測 采集所有受試者空腹靜脈血5ml，EDTA抗凝，3 000r/min離心10min，收集細(xì)胞，根據(jù)全血基因組DNA提取試劑盒(美國amresco)說明書提取總DNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測DNA樣品OD值，OD260/OD280為1.6～1.8合格后置于4℃冰箱保存待用。根據(jù)NCBI基因庫中IL-6(NC_000007.14:22725889-22732002)基因序列并利用NCBI Primer-BLAST設(shè)計(jì)PCR引物，IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)-572C/G位點(diǎn)上游引物：5’-GCTATGGAAGGGTCCTACTCAG-3’；下游引物：5’-ATCCTTTGCAGTGGAGGGATG-3’。IL-6-174G/C位點(diǎn)上游引物：5’-TGCTATGGAAGGGTCCTACTC-3’；下游引物：5’-AATCCTTTGCAGTGGAGGGA-3’，PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min，96℃變性30s，60℃ 退火30s、72℃ 延伸15s 共40個(gè)循環(huán)，室溫冷卻1min。采用PCR-RFLP檢測基因多態(tài)性：將純化后的PCR產(chǎn)物置于37℃恒溫箱中，分別加入相應(yīng)的HinfI限制性內(nèi)切酶(百奧萊博)進(jìn)行酶切反應(yīng)，4h后用2%的瓊脂糖凝膠處理酶切產(chǎn)物并在90V電壓下電泳30min，溴化乙淀染色，利用凝膠成像系統(tǒng)分析鑒定基因型，并統(tǒng)計(jì)兩組基因型的分布情況。

1.3 觀察指標(biāo) 收集兩組受試者年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、家族史等一般資料；統(tǒng)計(jì)受試者基因型及等位基因分布情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究采用SPSS21.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用χ2值檢驗(yàn)各組基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，采用二元Logistic回歸進(jìn)一步分析基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組受試者的年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒及家族史情況比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但觀察組患者接觸史比例顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 觀察組和對照組的IL-6基因-174G/C、-572C/G位點(diǎn)基因型的實(shí)際分布頻率和預(yù)期頻率分布均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，均符合遺傳平衡，提示研究對象具有群體代表性。見表2、3。

表2 IL-6-174G/C位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)

表3 IL-6-572C/G位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)

2.3 基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的關(guān)系 兩組IL-6-174G/C位點(diǎn)基因型和等位基因分布無顯著差異(P>0.05)，-572C/G位點(diǎn)基因型頻率無顯著差異(P>0.05)，但其等位基因頻率比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各基因型組內(nèi)比較，結(jié)果顯示觀察組-572C/G位點(diǎn)CC基因型頻率顯著升高(χ2=4.186，P=0.041)，見表4和表5。

表4 IL-6-174G/C位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較[頻數(shù)(頻率)]

表5 IL-6-572C/G位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較[頻數(shù)(頻率)]

2.4 肺結(jié)核易感性的二元Logistic回歸分析 以是否肺結(jié)核(是=1，否=0)為因變量，以一般資料及-572C/G位點(diǎn)基因型為自變量進(jìn)行二元Logistic回歸分析(向前：條件)，其中賦值-572C/G位點(diǎn)基因型CC=1、(CG+GG)=0，結(jié)果顯示IL-6 基因-572C/G位點(diǎn)CC基因型是肺結(jié)核易感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表6。

表6 肺結(jié)核易感性多因素二元Logistic回歸分析

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，約10%的結(jié)核分枝桿菌感染者可轉(zhuǎn)化為活動(dòng)性肺結(jié)核，并且發(fā)病率隨種族、地域的不同而出現(xiàn)顯著的差異[6]，提示肺結(jié)核的易感性與基因遺傳特征具有一定的關(guān)聯(lián)性。近年來，隨著對肺結(jié)核研究的不斷深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)白介素家族IL-37、IL-18、IL-10等多個(gè)成員的基因多態(tài)性可能與肺結(jié)核的易感性有關(guān)[7-9]。IL-6是IL家族的重要成員，在炎癥、免疫及惡性腫瘤等生理病理過程中均發(fā)揮重要作用，其部分多態(tài)性位點(diǎn)可能通過影響其表達(dá)水平或活性影響疾病的發(fā)生進(jìn)展。研究已證實(shí)IL-6參與調(diào)節(jié)肺結(jié)核細(xì)胞的免疫反應(yīng)[10]，但I(xiàn)L-6基因多態(tài)性是否與肺結(jié)核易感性存在相關(guān)性尚不清楚。因此，本研究對IL-6基因-174G/C、-572C/G位點(diǎn)開展研究，初步探討IL-6基因-174G/C、-572C/G位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的相關(guān)性。

IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，主要由T細(xì)胞、B細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)等作用，與多種疾病的病理過程密切相關(guān)。IL-6基因位于7p21染色體上，其蛋白結(jié)構(gòu)由4個(gè)α螺旋和C端受體組成。IL-6啟動(dòng)區(qū)存在多種單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，-174G/C、-572C/G位點(diǎn)是目前研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，關(guān)于其與疾病相關(guān)性的研究主要集中在心腦血管疾病、炎癥感染、免疫性疾病等疾病上[11-12]，而在肺結(jié)核等肺部疾病上的研究相對較少。有研究表明IL-6基因-572C/G位點(diǎn)CG及GG基因型是急性腦梗死患者繼發(fā)肺部感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13]；李小莉等進(jìn)行了Meta分析發(fā)現(xiàn)IL-6基因-572C/G位點(diǎn)多態(tài)性可能與慢阻肺易感性存在一定的關(guān)聯(lián)[14]；在肺結(jié)核的研究中，李洋等的研究表明，中國漢族人群肺結(jié)核患者IL-6基因rs2069837、rs1554286位點(diǎn)呈多態(tài)性分布，與肺結(jié)核感染存在相關(guān)性[15]；而早期孫永紅分析了漢族人群IL-6啟動(dòng)區(qū)-174G/C、-572C/G及-579G/A位點(diǎn)不同基因型與肺結(jié)核易感性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)-174G/C、-579G/A位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核易感性無關(guān)，但I(xiàn)L-6-572C/G位點(diǎn)多態(tài)性可能與肺結(jié)核發(fā)病相關(guān)，CC基因型可能是肺結(jié)核易感性的危險(xiǎn)因素[16]；同樣汪文斐的研究也表明IL-6-572C/G位點(diǎn)多態(tài)性可能與肺結(jié)核有關(guān)，肺結(jié)核組患者的G等位基因頻率低于對照組，攜帶G等位基因可能是肺結(jié)核易感的保護(hù)因素[17]。但關(guān)于IL-6啟動(dòng)子區(qū)位點(diǎn)的基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感相關(guān)性的研究仍相對較少，結(jié)論仍需更進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。因此，本研究分析了河南地區(qū)漢族肺結(jié)核患者與對照人群的IL-6 基因-174G/C、-572C/G位點(diǎn)基因型分布情況，結(jié)果顯示兩組IL-6 基因-174G/C位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而IL-6-572C/G位點(diǎn)等位基因分布頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且肺結(jié)核患者-572C/G位點(diǎn)CC基因型分布頻率顯著高于正常人群(P<0.05)，進(jìn)一步二元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)IL-6-572C/G位點(diǎn)CC基因型是肺結(jié)核易感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=3.846，P=0.011)，與現(xiàn)有研究結(jié)果基本一致。但由于本研究樣本量少，屬于小范圍單中心研究，后續(xù)還需擴(kuò)大樣本進(jìn)行多種族的高質(zhì)量流行病學(xué)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)-572C/G位點(diǎn)多態(tài)與肺結(jié)核易感性相關(guān)，其中CC基因型是肺結(jié)核易感性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)論為肺結(jié)核易感人群的早期篩查、預(yù)防及制定干預(yù)措施提供了一定理論依據(jù)。