青藏高原高寒草甸六種雜類草植物種子萌發期抗旱性研究

張春輝，馬 真，任彥梅，武 林，姚步青，黃小濤，馬 麗，郭 婧，周華坤

(1.青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧 810016； 2. 中國科學院西北高原生物研究所青海省寒區恢復生態學重點實驗室，青海 西寧 810008； 3. 中國科學院高原生物適應與進化重點實驗室，青海 西寧 810008；4. 青海省社會科學院，生態環境研究所，青海 西寧 810000)

種子的產生代表著一段生活史的結束，也預示著新的生活史的開始。對于很多植物來說，有機會萌發的種子只是自身產生種子中很少的一部分，而這僅有的一部分種子在萌發過程中會受到各種環境因素的影響(光照、水分、溫度等)[1-3]。種子在面對這些不確定環境因子時的萌發策略，決定著它后續的成功與否。

干旱是植物整個生活史中都必須要面對的一個重要問題[4-5]，而種子萌發階段作為生活史的開始，對干旱的響應尤其敏感而關鍵。該階段的抗旱性直接影響著物種的建植、種群的擴張，以及群落結構。研究認為，植物種子的萌發率通常會隨著干旱脅迫程度的加劇而降低[6-7]。聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)是一種親水性物質，因無法透過細胞壁而對種子沒有傷害，通常被用來模擬自然干旱脅迫從而研究植物萌發期抗旱性[8-9]。

種子大小是植物的關鍵性狀之一，也是它的生活史中第一個起決定性作用的性狀。不同的種子大小代表了種子內部儲存營養物質的含量，而種子儲存營養物質的含量決定了它在逆境條件下的耐受力[10]。對植物種群內不同大小種子的萌發研究中發現，逆境條件下，大種子比小種子具有更強的耐受性[11]。在對干旱脅迫下文冠果種子大小和萌發關系的研究中發現，高濃度PEG脅迫下，大種子萌發率比小種子高[12]。對干旱脅迫下的側柏種子萌發研究中同樣發現，大種子比小種子更具有優勢[13]。種子大小和萌發干旱耐受性關系的研究多基于物種種內的種子大小變異，而在不同物種間種子大小和萌發干旱耐受性的關系研究較少。研究物種間種子大小和萌發干旱耐受性的關系對于抗旱物種的篩選具有重要的意義。種子相關的其它性狀和干旱耐受性關系的相關研究鮮有報道。

高寒草甸廣泛分布于青藏高原，是青藏高原最為主要的植被類型[14]。青藏高原高寒草甸生態系統有著較高的生物多樣性[15]。但在土地利用和氣候變化的選擇壓力下，高寒草甸面臨著前所未有的挑戰[16]。種子資源是退化草地恢復的重要保障[17]。對干旱脅迫下種子抗逆性的研究，可以為退化草地恢復的種質資源利用和保護提供理論依據。

雜類草植物作為高寒草甸植物群落中不可或缺的一部分，是高寒草甸主要的功能群之一[18]。雜類草植物分布較廣，且種子產量較高，是構建人工群落時物種收集和選取的優良材料。由此我們選擇了高寒草甸常見的六種雜類草植物種子，對其不同干旱脅迫強度下的抗旱性進行了研究，以期明晰干旱脅迫下種子相關性狀和干旱耐受性的關系，為退化草地恢復中抗旱物種的篩選提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

試驗所需植物種子采集于青藏高原東北部(37°29′～37°45′ N，101°12′～101°23′ E，海拔3 200 m)的青海省海北州門源縣境內的中國科學院海北高寒草甸生態系統定位站。該區年降水量為561 mm，主要分布于6—9月；年均溫0.8℃，屬于典型的高原大陸性氣候。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗種子采集及前處理 試驗材料于種子成熟期(8—9月)采集，每一物種選取3個以上種群，每一種群隨機選取 20株以上的植株。將采集后的種子帶回實驗室進行去皮去雜等處理，將處理完成的種子放于野外(種子采集地)，次年春季取回后進行試驗。具體物種見表1。

表1 六種雜類草植物物種名及種子大小Table 1 Species names and seed sizes of six weed species

1.2.2PEG干旱脅迫試驗 試驗使用不同濃度的聚乙二醇溶液模擬不同程度的干旱。選擇飽滿、健康種子進行干旱脅迫試驗，每個物種四個重復，每個重復25粒種子。根據前期研究經驗，并結合當前的研究方法，選取了0%(對照)，10%，20%三個PEG濃度。種子放于鋪有兩層濾紙的培養皿內，分別加入適量PEG溶液。萌發試驗在培養箱(溫度15～20℃，黑暗/光照：10 h/14 h)內進行，每3天更換一次濾紙和溶液，以維持溶液水勢不變。以胚芽長度為種子長度的1/2作為萌發標準，從種子置于培養皿第二日開始每天記錄發芽種子數，連續7天培養皿內沒有發芽種子視為萌發結束。

1.2.3種子大小測定 隨機選取飽滿健康的種子進行試驗，并用萬分之一的電子天平稱量每種植物種子的百粒重，重復3次，最后換算成單粒種。每一物種的單粒種子重量作為種子大小。

1.3 數據分析

1.3.1萌發指標及計算方法： 萌發率(Germination proportion)=(試驗結束時萌發的種子總數/試驗處理種子總數)×100%；

萌發干旱耐受性(Drought tolerance during seed germination)=1-(對照下的萌發率-PEG處理的萌發率)/PEG處理的萌發率。

萌發干旱耐受性的取值范圍為0～1，其取值越接近1表明萌發干旱耐受性越高，其取值越接近0表明萌發干旱耐受性越低。

1.3.2數據統計與分析方法 使用R軟件計算物種間系統發育距離。使用SPSS 22.0 軟件進行后續數據統計與分析，用T檢驗(T test)檢驗顯著性水平，應用一般線性回歸檢驗種子大小和萌發率與萌發干旱耐受性的回歸關系以及物種間系統發育距離和萌發干旱耐受性差異的回歸關系。

2 結果與分析

2.1 六種雜類草植物在不同干旱脅迫強度下的萌發率

2.1.1六種雜類草植物種間萌發率 六種雜類草植物萌發率在對照條件下，10% PEG干旱脅迫下，20% PEG干旱脅迫下差異均顯著(P<0.05，圖1)。

對照條件下，萌發率在75%～100%的物種有三個，萌發率最高的物種為尼泊爾蠅子草(Silenenepalensis)，對照條件下萌發率為97.96%；其次為天藍韭(Alliumcyaneum)，萌發率為83.50%，兩者萌發率差異不顯著；藍翠雀花(Delphiniumcaeruleum)萌發率為75.56%，顯著低于尼泊爾蠅子草(P<0.05)。萌發率在50%～75%的物種為蓬子菜(Galiumverum)(萌發率為68.35%)。萌發率在25%～50%的物種為青海當歸(Angelicanitida)(萌發率為40.38%)。萌發率在0～25%的物種為半抱莖葶藶(Drabasubamplexicaulis)(萌發率為20.10%)，顯著低于其它5個物種(P<0.05，圖1a)。

10% PEG干旱脅迫下，萌發率在50%～75%的物種有天藍韭(萌發率為72.62%)，尼泊爾蠅子草(萌發率為63.37%)，藍翠雀花(萌發率為59.83%)。萌發率在25%～50%的物種為蓬子菜(萌發率為40.83%)。萌發率在0～25%之間的物種為青海當歸(萌發率為24.00%)和半抱莖葶藶(萌發率為3.13%)，在該處理條件下半抱莖葶藶萌發率顯著低于其他5個物種(P<0.05，圖1b)。

20% PEG干旱脅迫下，各物種萌發率均在0～25%之間。萌發率最高的物種為尼泊爾蠅子草，萌發率為20.12%，顯著高于其它5個物種(P<0.05)。其余物種萌發率均低于10%，其中天藍韭萌發率為6.94%，藍翠雀花萌發率為6.25%，蓬子菜萌發率1.14%，3個物種萌發率差異不顯著。完全不萌發的物種有青海當歸和半抱莖葶藶，萌發率均為0(圖1c)。

圖1 六種雜類草植物種間萌發率比較Fig.1 Comparison of germination rates of six forbs species注：不同小寫字母代表不同物種間萌發率差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters showed significant differences among different species at the 0.05 level

2.1.2六種雜類草植物種子萌發率對PEG干旱脅迫的響應 六種雜類草植物萌發率在三種處理間均差異顯著的物種為尼泊爾蠅子草和蓬子菜。尼泊爾蠅子草為對照條件下萌發率最高的物種，萌發率為97.96%；10%PEG干旱脅迫下萌發率為63.37%；20%PEG干旱脅迫下萌發率為20.12%，三種處理間差異顯著(P<0.01)(圖2f)。蓬子菜對照條件下萌發率為68.35%；10%PEG干旱脅迫下萌發率為40.83%；20%PEG干旱脅迫下萌發率為1.14%，三種處理間差異顯著(P<0.01)(圖2e)。

三種雜類草植物在10%PEG濃度下的萌發率顯著低于對照。除了蓬子菜和尼泊爾蠅子草，還有半抱莖葶藶。半抱莖葶藶為對照條件下萌發率最低的物種，對照條件下萌發率為20.10%；10%PEG干旱脅迫下萌發率為3.13%；20%PEG干旱脅迫下萌發率為0，三種處理間差異顯著(P<0.01)(圖2d)。

所有物種在20%PEG濃度下的萌發率都顯著低于對照(圖2)。除半抱莖葶藶，其它5個物種在20%PEG濃度下的萌發率都顯著低于10%PEG濃度(P<0.05)。

圖2 六種雜類草植物種子萌發率對PEG干旱脅迫的響應Fig.2 Response of seed germination proportion of six forbs to PEG treatment注：不同小寫字母代表不同PEG濃度萌發率差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters showed significant differences of seed germination among PEG treatment at the 0.05 level

2.2 種子性狀和萌發干旱耐受性關系研究

種子大小和萌發干旱耐受性呈現顯著正相關關系(P=0.015；R2=0.809)，隨著種子質量的增加，種子的抗旱性增加(圖3a)，半抱莖葶藶種子對干旱脅迫的耐受性最低，種子質量為0.04 mg；青海當歸種子對干旱脅迫的耐受性最高，種子重量為1.71 mg。

六種不同大小的雜類草植物種子初始萌發率差異顯著(圖1a)，尼泊爾蠅子草對照條件下萌發率為97.96%，而半抱莖葶藶萌發率僅為20.10%，反映了這些物種具有不同程度的休眠。然而種子萌發率(即休眠程度)和萌發干旱耐受性沒有顯著回歸關系(P=0.148,圖3b)。

圖3 種子性狀和萌發干旱耐受性回歸圖Fig.3 Relationship between seed traits and drought tolerance during germination

2.3 系統發育和萌發干旱耐受性關系研究

結果表明物種間系統發育距離和萌發干旱耐受性沒有顯著回歸關系(P=0.887,圖4)，這說明系統進化對六種物種間萌發干旱耐受性分化沒有影響。

圖4 物種間系統發育距離和萌發干旱耐受性差異的回歸圖Fig.4 Relationship between phylogenetic distance and differences of drought tolerance during seed germination between species

3 討論

種子萌發階段是植物生活史的重要階段，而種子萌發階段的抗旱性強弱是影響該階段成功與否的重要因子。研究結果表明，不同濃度的PEG干旱脅迫對六種高寒草甸雜類草植物種子的萌發都具有一定的抑制作用。種子的萌發率隨著干旱脅迫強度的增加而下降，這與相關的研究結果一致[19-20]。較低濃度PEG(10%)干旱脅迫處理下，天藍韭、藍翠雀花、青海當歸雖然有下降趨勢，但與對照差異不顯著，這三個物種可能對該程度的干旱脅迫有一定的耐受性；而半抱莖葶藶、蓬子菜、尼泊爾蠅子草與對照下的萌發率差異顯著，這幾個物種的萌發率在較低PEG干旱脅迫下就發生了顯著的變化。較高濃度PEG(20%)干旱脅迫處理下，六種雜類草植物種子萌發率都與對照差異顯著。其中半抱莖葶藶種子萌發率下降最多，10%PEG干旱脅迫下降至對照處理下的1/4，20%PEG干旱脅迫下降至0，該物種對干旱脅迫最為敏感。

種子大小是植物的關鍵性狀，決定著種子內部儲藏物質以及相關的耐受性。通常來說，質量大的種子會具有更強的耐受性和存活能力[21-22]，而小種子物種在數量和傳播方式方面更具有優勢[23]。本研究結果表明，種子萌發階段對干旱脅迫的耐受性隨著種子質量的增加而增加，大種子物種在萌發階段具有較高的干旱耐受性，而小種子物種的萌發更容易受到干旱脅迫的影響。半抱莖葶藶種子質量為0.04 mg，對干旱脅迫的耐受性最低，青海當歸種子重量為1.71 mg，對干旱脅迫的耐受性最高。郭有燕和付錦雪對種群內不同大小種子抗旱性的研究中有相似的發現[12-13]。大種子物種萌發階段在干旱脅迫或其它逆境條件下的耐受性，部分抵消了小種子的數量優勢，為逆境條件下大種子物種的建植成功提供了機會[24]。

六種不同大小的雜類草植物種子初始萌發率差異顯著，尼泊爾蠅子草對照條件下萌發率為97.96%，而半抱莖葶藶萌發率僅為20.10%，反映了這些物種具有不同程度的休眠。但在不同程度的干旱脅迫下，即使這些物種具有不同程度的休眠，種子大小和萌發干旱耐受性之間仍保持著顯著正相關關系。

一般而言，系統進化歷史可以影響物種特性的分化[25]。然而，我們的研究中沒有發現系統進化歷史影響物種萌發耐旱性的分化。這可能是因為萌發耐旱性像其他萌發特性一樣，有著一定的本地適應性或者環境可塑性[26]，從而導致我們研究的物種間萌發耐旱性可能出現了趨同化，最終掩蓋了系統進化歷史的影響。

4 結論

不同濃度PEG處理對六種雜類草植物種子萌發都有不同程度的抑制作用。隨著PEG濃度的增加，種子的萌發率呈降低趨勢。其中較低濃度PEG(10%)脅迫處理對部分植物的種子萌發具有顯著的抑制作用，而較高濃度的PEG(20%)脅迫處理對六種雜類草植物種子萌發均有顯著的抑制作用。種子大小和干旱耐受性正相關，隨著種子質量的增加，種子萌發階段的抗旱性增加；而萌發率和系統發育距離與萌發干旱耐受性沒有顯著相關性。綜上，可以優先考慮大種子物種作為退化草地恢復中抗旱物種。