添加劑對黑麥草青貯品質及微生物數量的影響

付志慧, 格根圖*, 賈玉山, 王志軍, 孫 林, 南丁罕, 岳正山, 閆 峰，任秀珍

(1.內蒙古農業大學草原與資源環境學院，農業農村部飼草栽培、加工及高效利用重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010019；2.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特010031； 3.內蒙古正奇農牧業有限公司，內蒙古 呼和浩特 010031；4.內蒙古民族大學農學院，內蒙古自治區飼用作用工程技術研究中心，內蒙古 通遼 028000)

黑麥草(Loliumspp.)是一種生長速度快、產量高、品質優、適口性好的優質牧草，深受各種家畜喜愛[1]，常做青貯飼料的原料，是歐洲奶牛養殖的首選飼草品種。在我國，屬南方地區的優勢草種，多用做作物倒茬、草田輪作、種草養畜等，但由于其在北方地區不能安全越冬的生長特性，在北方地區尚未推廣開來，但實現牧用黑麥草規模化集約化生產，對于我國各地區“就地就近保障飼草料供應，實現農牧循環發展”，具有重要意義。

由于黑麥草刈割時其鮮草含水量高達80%以上，若不經處理直接青貯容易導致丁酸發酵[2]。一般情況下將原料直接青貯，植物表面附生的有害微生物會在發酵進程中水解蛋白質，造成干物質大量損失，從而影響青貯發酵品質[3]。因此，在加工調制時選擇恰當的添加劑來促進青貯發酵過程或提高青貯飼料的有氧穩定性已成為一種常規青貯手段。田允波[4]、楊雪霞[5]、Rauramaa A等[6]研究表明調制青貯飼料時添加乳酸菌外源添加劑、纖維素酶制劑等，均會改善青貯飼料的發酵品質，促進乳酸發酵進程、提高青貯飼料的消化率。

青貯飼料是一個復雜的微生物共生體系[7]，牟林林等[8]研究表明青貯發酵進程是諸多微生物共同作用的結果，這些微生物主要分為兩大類，即對發酵起著積極作用的有益微生物和降低發酵品質的有害微生物。有益微生物包含植物乳桿菌等微生物，主要產生乳酸迅速降低pH值，同時包含抑制梭菌發酵的同型發酵乳酸菌和發酵糖等，還包括產生乳酸、乙酸和乙醇等的異型發酵乳酸菌，均能使青貯料保持良好的有氧穩定性，延長保存時間；有害微生物包括一般好氧性細菌、霉菌和梭菌等[8]。一般好氧性細菌常分解蛋白質和氨基酸從而產生NH3；霉菌較易分解糖和乳酸，會導致青貯料發生有氧腐敗；梭菌一般在厭氧狀態下生長會分解利用糖、有機酸和蛋白質，從而產生丁酸及氨等物質，也是導致青貯腐敗的常見原因之一[9-10]。因此，研究青貯前后微生物數量的變化十分重要。目前，針對黑麥草青貯及添加劑對黑麥草青貯品質的影響研究頗多，但結合添加劑對青貯品質及青貯前后微生物數量變化的研究鮮見報道。本研究旨在探討不同添加劑對北方地區黑麥草青貯前后微生物數量的變化及發酵品質的影響，為黑麥草在北方地區規模化生產中選擇優質添加劑提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料是品種為‘特高’的多花黑麥草，于2019年5月26日種植于內蒙古農業大學牧草試驗基地，同年9月2日(孕穗期)第4茬刈割，萎蔫至含水量65%左右，作為青貯原料，原料成分見表1。所用添加劑為A1(植物乳桿菌：由日本國際農林水產研究中心蔡義民研究員惠贈)、A2(復合菌劑：乳酸菌+纖維素酶，購自日本雪印會社)、A3(商業菌劑：和美科盛乳酸菌標準品+糖蜜，由內蒙古正奇農牧業有限公司提供)。

表1 多花黑麥草原料化學成分及微生物數量Table 1 Chemical composition and microbial quantity of Italian ryegrass before ensiling

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計 試驗采用單因素隨機區組設計，設置4個處理，分別為對照(CK)、A1(植物乳桿菌、2.5 g·t-1)、A2(復合菌劑、17 g·t-1)、A3(商用菌劑、1 000 g·t-1)，添加量以鮮重計算，使用時活菌數106cfu·g-1，每個處理3次重復。將收獲的黑麥草萎蔫至含水量65%左右，切短至3～5 cm，攪拌均勻，裝入聚乙烯青貯袋，每袋300 g左右，采用真空封口機抽氣密封，放于室內常溫條件下避光保存，青貯60 d后開袋，將樣品混勻后進行青貯飼料感官評價、營養品質、發酵品質及微生物數量分析。

1.2.2樣品處理 青貯60 d后開袋取樣，將樣品攪拌混合均勻，稱取10 g樣品與90 mL無菌水混合均勻，放入拍打袋中用均質拍打器(品牌為凈信，上海凈信實業發展有限公司購買)拍打120 s，制備浸提液，用定性濾紙過濾后置于離心管中于-35℃冰箱保存待測發酵品質。另取10 g樣品置于三角瓶中，加入90 mL無菌水、無菌生理鹽水(0.85%NaCl)，用封口膜封口，用于測定微生物數量。將剩余青貯樣品收集置大號信封紙袋中，105℃烘箱中殺青30 min后再將溫度調至65℃烘干48 h至恒重，用于待測營養品質。

1.3 測定指標及方法

1.3.1感官品質評價 根據德國農業協會(DLG)感官青貯評定方法及等級標準[8]從氣味、結構、色澤3方面進行評價，滿分為20分，20～16分為優良，15～10分為尚好，9～5分為中等，4～0分為腐敗，評定標準見表2。

表2 青貯飼料感官品質評定標準Table 2 Sensory quality evaluation standards of silage

1.3.2營養品質測定 采用烘干法[11]進行干物質(Dry matter，DM)含量的測定；使用FOSSKJ2300型全自動定氮儀進行粗蛋白質(Crude protein，CP)含量測定[11]；采用GB6439-92燃燒法進行有機物(Organic matter，OM)含量測定[11]；采用ANKOMA2000i全自動纖維儀進行中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber，NDF)含量測定[12]；采用蒽酮-硫酸比色法進行可溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates，WSC)含量測定[13]。

1.3.3發酵品質測定 用pH計測定取樣品處理時制備的浸提液的pH值[14]；使用高效液相色譜儀(HPLC)測定乳酸(Lactic acid，LA)、乙酸(Acetic acid，AA)、丙酸(Propionic acid，PA)和丁酸(Butyric acid，BA)含量，并計算乳酸/乙酸(LA/AA)及總酸(Total acid，TA)的含量，從而分析濾液中的有機酸的含量[15]；氨態氮(NH3-N)含量用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[15]。以氨態氮和揮發性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFA)為評價指標，選用日本草地畜產協會(2001)制定的青貯飼料發酵品質V-Score評分標準[16]。

1.3.4微生物數量測定 用樣品處理時制備的待測微生物數量的菌液，稀釋10-1，10-3，10-5，采用平板計數法計算微生物數量[17]。乳酸菌采用乳酸菌固體(De Man，Rogosa and Sharpe，MRS)培養基，霉菌和酵母菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培養基，大腸桿菌采用大腸菌群液體顯色(Blue Light Broth Agar，BLB)培養基，一般好氧性細菌采用營養瓊脂(Nutrient Agar，NA)培養基，乳酸菌30℃厭氧培養箱中培養48 h后計數，酵母菌、霉菌、一般好氧性細菌、大腸桿菌置于30℃恒溫培養箱中培養48 h后計數，所有微生物數據采用lg(cfu)·g-1of FM表示[18]。

1.4 數據處理

利用Excel 2016進行試驗數據的基礎整理與表格繪制，使用SAS 9.4進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，平均值間差異顯著性用Duncan氏法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同添加劑對青貯飼料感官品質的影響

由表3可知，添加劑處理組的青貯飼料感官評分均高于CK，其中A2得分最高為19分，其芳香味較濃，莖葉結構保持良好；A3得分略低于A2，其有明顯的芳香味；A1得分低于A3，其芳香味次于A3，莖葉結構稍有改變，但不明顯；添加添加劑處理的青貯色澤與原料相似，烘干后呈淡褐色，A2，A3總體表現為1級(優良)，A1，CK表現為2級(尚好)。

表3 不同添加劑處理對青貯飼料感官品質評價結果Table 3 Evaluation results of sensory quality of silage in different additive treatments

2.2 不同添加劑對青貯飼料營養品質的影響

由表4可知，青貯60 d后，A1，A2和A3的DM含量均顯著低于CK(P<0.05)。A1處理組的CP含量高于CK,A2和A3，各處理組同CK之間差異不顯著。各處理組的OM含量從高到低分別為CK>A1>A2>A3，各處理組同CK相比差異不顯著。各處理組的NDF含量從高到低依次為A3>CK>A1>A2，其中A2的含量顯著低于A3(P<0.05)。A1，A2，A3的WSC含量顯著低于CK(P<0.05)。

2.3 不同添加劑對青貯飼料發酵品質的影響

由表5可知，各添加劑處理組的pH值均顯著低于CK(P<0.05)，且均低于4.2。A1,A3的LA含量顯著低于CK(P<0.05)，A2的LA含量最高，為88.38 g·kg-1，顯著高于CK,A1和A3(P<0.05)。A3的AA含量最低，為2.38 g·kg-1，顯著低于CK,A1和A2(P<0.05)。A2,A3的BA含量均顯著低于CK和A1(P<0.05)。A1，A3的總酸含量顯著低于CK(P<0.05)，A2的總酸含量高于CK，但差異不顯著；A2的LA/AA的比值最高，且顯著高于CK(P<0.05)；各處理組的NH3-N含量均高于CK，其中A1和A3顯著高于CK(P<0.05)。

表5 不同添加劑處理對青貯飼料發酵品質的影響Table 5 The effects of different additives on the fermentation quality of silage

2.4 不同添加劑對青貯飼料微生物數量的影響

由表6可知：青貯60 d開袋后，各處理組乳酸菌的數量均高于CK，但差異不顯著，其中A3乳酸菌數量最多，為8.58(lg(cfu)·g-1FW)；酵母菌、霉菌及大腸桿菌均未檢測到；A3中一般好氧性細菌的數量顯著低于CK和A1(P<0.05)，且為最低，A2較CK一般好氧性細菌數量下降，但差異不顯著。

表6 不同添加劑處理對青貯飼料微生物數量的影響Table 6 The effects of different additive treatments on the microbial population of silage

2.5 不同添加劑青貯飼料的V-Score評分

由表7可知,A1，A3組氨態氮/總氮顯著高于CK(P<0.05)，A2，A3組乙酸+丙酸的含量小于0.5%，各處理組的丁酸含量均在0.5%以下，其中A2的丁酸含量最低，計算得到的V-Score評分值最高，為86.26分，評分等級為良好。

表7 不同添加劑青貯飼料的V-Score評分Table 7 V-Score scores of different additive silages

3 討論

3.1 不同添加劑處理對青貯飼料感官品質的影響

感官評價方法簡潔易行，由于不需要任何儀器設備，所以在生產應用中比較常見[19]。高品質的青貯料在嗅覺上具有酸香味，不僅莖、葉結構保存較完整，而且在顏色上也呈現黃綠色，與原料較接近[19]。本研究結果表明，添加外源添加劑的各處理組青貯飼料感官評分均高于CK，其中A2,A3感官品質均評價為優良。說明在調制青貯飼料時，添加劑的介入能明顯改善青貯飼料的感官品質。

3.2 不同添加劑處理對青貯飼料營養品質的影響

營養成分是反映飼草利用價值的重要指標[18]。在青貯過程中，由于參與發酵進程的乳酸菌需要水分來促進其生長和繁殖，所以DM含量對青貯發酵有很大影響[20]。在本研究中，隨著添加劑的加入，各處理組DM含量均顯著低于CK，說明在青貯發酵過程中DM均有損耗，有研究表明，在青貯發酵的有氧階段，有氧微生物的生長而帶來的DM損失通常是不可避免的[21]，這也是由于乳酸菌和纖維素酶都是促進發酵型添加劑，在發酵進程中乳酸菌和纖維素酶會使青貯飼料迅速發酵，因而增加了對DM的消耗。NDF是反映飼料纖維質量優劣的關鍵指標之一，其含量高低在實際生產應用中可作為估測奶牛日糧精粗比是否合適的重要依據[18]。A2處理組的NDF含量低于對照組，這可能是微生物發酵將纖維素分解形成揮發性脂肪酸[22]。在青貯料中添加含有纖維素酶成分的添加劑有助于促進植物細胞壁的快速分解，從而使植物纖維成分含量下降，改善牧草的營養價值，進一步提高其利用價值[23]。司丙文等[23]研究發現添加酶菌復合制劑有助于NDF的降解，在本試驗中A2處理組NDF含量最低，此研究結果與其研究結果保持一致。A3處理組中加入添加劑后NDF含量上升，這與丁武蓉等[24]研究結果不一致，可能是由于青貯原料與添加劑中乳酸菌種類不同有關。WSC是產生乳酸以降低酸堿度的乳酸菌生長過程中的重要底物[20]，在本研究中各處理組的WSC含量顯著低于對照組，說明外源添加劑的加入提高了乳酸菌在發酵進程中對底物的利用效率，其中A1處理組的WSC含量顯著最低，說明加入乳酸菌添加劑后，乳酸菌在發酵過程中利用了更多的WSC作為底物去調控整個發酵過程，導致A1處理組的青貯料中剩余的WSC含量較少，這與劉輝等[25]研究結果一致。

3.3 不同添加劑處理對青貯發酵品質的影響

添加劑是影響青貯發酵品質的關鍵要素，不同的添加劑處理，青貯料的品質也不相同[26]。在本研究中，隨著添加劑的加入，與對照相比，各處理組pH值顯著降低，且均低于4.2，說明各添加劑處理有效的改善了黑麥草青貯的發酵品質。其中A2處理組pH值最低，主要是由于纖維素酶對青貯料細胞壁的破壞作用，使細胞內容物順利流出，保證乳酸菌發酵時底物充足，使得乳酸菌充分發酵從而產生大量的乳酸以降低pH值，從而進一步提高發酵品質[24]，丁武蓉等[24]也得到相同的研究結果。V-Score評分體系是評價青貯飼料發酵品質常用且重要方法之一[25]，PA作為青貯飼料中重要的揮發性脂肪酸，其具有抗真菌的作用，能夠有效的抑制青貯料的好氧腐敗，有利于保存青貯飼料營養成分[27]。本研究中，各處理組的PA含量均高于對照組，且A2組的PA含量最高，BA含量顯著低于其他處理組及對照組，且為最低；A2組中總酸的含量高于對照組，但差異不顯著，王繼成等[28]研究也提出，隨著酶量的增加，青貯飼料中總有機酸含量有提高的趨勢，本試驗結果與其基本一致。本試驗中，A2組中LA含量顯著高于CK及其他處理組，且V-Score評分最高，等級為良好，說明A2組的發酵品質最好。青貯飼料中NH3-N的產生主要由于植物酶對蛋白質的降解和微生物分解利用蛋白質和氨基酸共同作用的結果[24]，以此來反映青貯料中蛋白質的降解程度。A1處理組中，AA含量上升，LA含量下降，這可能與異型發酵中乳酸菌發酵將LA一部分轉化為AA的發酵特性有關[29]，AA含量的升高對提高青貯飼料的有氧穩定性起著至關重要的作用[30]。前人研究表明，AA和PA均能抑制好氣菌生長引起的青貯料腐敗變質[31]。

3.4 不同添加劑處理對青貯飼料微生物數量的影響

青貯料中乳酸菌的數量多少直接影響青貯發酵品質好壞，乳酸菌的生命代謝活動是青貯能否成功發酵的重要因素之一[18,32-33]。在本研究中，隨著添加劑的加入，乳酸菌的含量均高于對照組，與陳雷等[34]研究結果一致。各處理組中，A2組與A3組一般好氧性細菌數量均低于對照組，有害微生物數量的降低從某種程度上減少了青貯飼料的耗氧腐敗，減少了DM的損失[35]，提高了發酵品質。

4 結論

研究發現，3種添加劑對黑麥草青貯發酵品質以及微生物數量都有不同程度的改善，A2組的感官評定為優良，V-Score評分等級為良好，乳酸菌數量最多，一般好氧性細菌數量最少；為了提高黑麥草青貯飼料的感官品質、營養品質和發酵品質同時減少發酵過程中有害微生物的數量，增加有益微生物數量，在制作青貯飼料時添加復合菌劑(乳酸菌+纖維素酶)的效果最好。