膽汁酸代謝異常對Raw264.7細胞功能的影響*

周巧玲，王鑫銘，蘇涌，程龍浩，葛朝亮

(安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科，合肥 230022)

肝硬化是多種慢性肝病的終末期病變。感染是肝硬化患者最常見的嚴重臨床并發癥之一，肝硬化伴感染患者病死率較非感染患者提高4倍[1]。研究發現肝硬化患者感染的發病機制包括腸道微生物群、腸道通透性、細菌移位和免疫缺陷等。膽汁酸是在肝臟中由膽固醇合成的內源性類固醇分子，對維持機體葡萄糖和脂類的穩態具有重要作用。法尼醇受體(farnesoid X receptor，FXR)是膽汁酸合成和轉運的重要調節因子；肝損傷時，FXR表達下調，導致膽汁酸代謝紊亂[2]。研究表明肝硬化患者伴隨膽汁淤積，易繼發感染，且具有高病死率。動物實驗表明，膽管結扎小鼠模型的感染發生率以及嚴重程度均顯著上升[3]。巨噬細胞是機體重要的免疫細胞之一，作為固有免疫的重要組成部分，是抵御病原體的第一道防線，其通過模式識別受體識別病原體相關分子模式和損傷相關分子模式，介導免疫效應。巨噬細胞M1型極化可清除機體異物，但是在炎癥免疫反應異常亢進時，巨噬細胞通過釋放大量的細胞因子和趨化因子可引發組織損傷[4]。課題組前期研究發現，肝硬化患者體內的鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)、膽酸(cholic acid，CA)、脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)等代謝發生紊亂，其中CDCA和CA濃度升高，而DCA濃度下降[5]。但代謝異常的膽汁酸對機體炎癥免疫細胞功能的調控作用尚未闡明。細菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要組分之一，是感染后細菌產生毒性反應的主要介質。LPS作為重要的抗原分子被抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)捕獲，從而引起機體的免疫反應。巨噬細胞作為機體重要的APC在LPS的作用下，可顯著活化并發生M1型極化[6]。本研究選擇肝硬化患者3種主要代謝異常的初級膽汁酸，LPS用于模擬感染時巨噬細胞所處的微環境狀態，通過膽汁酸聯合LPS刺激巨噬細胞模擬膽汁淤積伴感染的體外模型，初步探究不同膽汁酸在肝硬化伴感染時對巨噬細胞功能的影響，以期為臨床肝硬化伴感染患者治療時維持膽汁酸穩態的重要性提供依據。

1 材料與方法

1.1儀器與設備 SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、Forma3111二氧化碳細胞培養箱(美國Thermo公司)、DMI1倒置顯微鏡(德國Leica公司)、C100細胞計數儀(山東博科科學儀器有限公司)、ELx800酶標儀(美國Bio-Tek公司)、Cytoflex流式細胞儀(美國Beckman公司)、KDC-1044低速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)、HC-3018R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

1.2藥物與試劑 CDCA(美國Sigma公司，貨號：C9377)、CA(美國Sigma公司，貨號：C1129)、DCA(美國Sigma公司，貨號：D2510)、LPS(美國Sigma公司，貨號：L2630)、二甲亞砜(DMSO)(Bioforxx，貨號：EZ6789B121)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(Biosharp公司，貨號：70115000)、Raw264.7細胞(由實驗室劉加濤老師課題組贈送)、RPMI-1640培養基(美國Gibco公司，貨號：8120429)、胎牛血清(美國Gibco公司，貨號：10270106)、青霉素-鏈霉素(Biosharp公司，貨號：BL505A)、CCK-8(APE×Bio，貨號：K101815133EF5E)、PE anti-mouse CD163(美國Biolegend公司，貨號：155308)、APC anti-mouse CD86(美國Biolegend公司，貨號：105012)、熒光素標記的右旋糖酐(FITC-Dextran，美國Sigma公司，貨號：FD40S)、細胞培養瓶(無錫耐思)、96孔細胞培養板(美國costar公司)、6孔細胞培養板(美國costar公司)。

1.3細胞培養 采用含 10% 胎牛血清1640培養基培養Raw264.7 細胞，在 37 ℃，5%二氧化碳(CO2)培養箱中培養至約80%傳代。

1.4膽汁酸與LPS配制 分別精密稱取CDCA 15.702 8 mg、CA 16.342 8 mg和DCA 15.702 8 mg，加入DMSO 200 μL溶解，配制成終濃度為200 mmol·L-1的母液，分裝于200 μL離心管，-20 ℃凍存。使用時用培養基稀釋至相應濃度。精密稱取LPS 3 mg，加入無菌PBS 6 mL溶解，用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，配制成濃度為0.5 mg·mL-1的母液，分裝，置于-20 ℃保存。使用時用培養基稀釋至相應濃度。

1.5CCK-8檢測細胞活力 取對數生長期的Raw264.7細胞，制成細胞懸液，以每孔2×104接種于96孔板，每孔加入細胞懸液50 μL。將96孔板放在培養箱中培養18～20 h，向孔中加入不同濃度的膽汁酸(25，50，100，150，200，400 μmol·L-1)50 μL，加入等體積培養基作為對照組，放入培養箱中，分別培養4，6和8 h。加入不同濃度的LPS(12.5，25，50，100，200，400，800，1000 ng·mL-1)50 μL，加入等體積培養基作為對照組，放入培養箱中分別培養2，4和6 h，每個濃度梯度設置6個平行復孔，向每孔中加入CCK-8溶液10 μL，將培養板放入培養箱培養1～4 h，用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度(A值)，用A值反映細胞活力。

1.6流式細胞術檢測細胞極化 根據CCK-8結果確定膽汁酸和LPS刺激的濃度和時間，分成5組(對照組、DMSO組、LPS組、膽汁酸組、膽汁酸聯合LPS組)處理細胞。將培養箱中24孔板取出，收集巨噬細胞1×106個，200×g離心5 min，棄上清液，加入含5%BSA的PBS重懸細胞，200×g離心5 min，棄上清液，加入PBS重懸，向實驗組中各加入APC anti-mouse CD86和PE anti-mouse CD163抗體，使CD86和CD163的終濃度分別為1.3和4 μg·mL-1，4 ℃避光孵育30～45 min，加入PBS，200×g離心5 min，重復兩次，每管加入PBS 200 μL，流式細胞儀上機檢測分析。

1.7流式細胞術檢測細胞吞噬功能 將Raw264.7細胞以每孔1×105接種于24孔板，按照上述實驗分組處理細胞，24 h后收集細胞，轉移至1.5 mL離心管，200×g離心5 min，棄上清液，每個離心管中加入無血清培養基稀釋的FITC-Dextran 300 μL，同時設置加入無血清培養基的空白對照組和FITC-Dextran 4 ℃的對照，混勻后將離心管分別放在37 ℃ 5%CO2的培養箱中和4 ℃冰箱中靜置90 min，加入PBS，200×g離心5 min，棄上清液，重復3次，加入PBS200 μL重懸，流式細胞儀上機檢測分析。

2 結果

2.1LPS對Raw264.7細胞活力影響 結果見圖1。與對照組比較，12.5～50 ng·mL-1LPS刺激Raw264.7細胞2 h，對細胞活力沒有影響，100～1000 ng·mL-1LPS處理細胞后，顯著上調細胞活力。與50 ng·mL-1組比較，100 ng·mL-1LPS處理后細胞活力顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。刺激4和6 h時，25～800 ng·mL-1的LPS處理的細胞活力均升高。100 ng·mL-1LPS在不同的時間點刺激細胞，結果顯示與刺激2 h比較，刺激4 h細胞活力顯著升高。

2.2CDCA對Raw264.7細胞活力影響 結果見圖2。與DMSO組比較，不同濃度CDCA處理Raw264.7細胞4 h時，細胞活力未發生變化。100～400 μmol·L-1CDCA 處理細胞6 h后，細胞的活力顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，150 μmol·L-1比100 μmol·L-1CDCA處理組細胞活力下降更為顯著。處理8 h時，150～400 μmol·L-1CDCA均可下調細胞的活力。

2.3CA對Raw264.7細胞活力影響 結果見圖3。與對照組比較，DMSO處理組細胞活力未發生顯著改變，用不同濃度CA處理Raw264.7細胞，4 h時，與DMSO組比較，CA濃度為100和200 μmol·L-1時細胞的活力顯著升高，100與50 μmol·L-1CA組比較細胞活力顯著升高。處理6 h時，50～200 μmol·L-1的CA處理組的細胞活力均升高；處理8 h時，50～200 μmol·L-1CA組與DMSO組比較細胞活力均升高。

①與對照組比較，t=4.63～15.46，P<0.05；②與LPS 50 ng·mL-1組比較，t=3.32～13.08，P<0.05；③與2 h組比較，t=4.61～6.07，P<0.05。

①與DMSO組比較，t=5.83， P <0.05；②與DMSO組比較，t=10.18～13.15，P<0.01；③與CDCA 100 μmol·L-1組比較，t=5.96～10.56，P<0.01。

2.4DCA對Raw264.7細胞活力影響 實驗結果見圖4。用不同濃度的DCA處理Raw264.7細胞4 h時，與DMSO組比較，200，400 μmol·L-1DCA刺激后細胞活力顯著下降，與150 μmol·L-1組比較，200 μmol·L-1DCA組細胞活力顯著下降；作用6 h時，150～400 μmol·L-1DCA處理后細胞活力顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)；作用8 h時，50～400 μmol·L-1DCA處理后均下調細胞活力。

2.5膽汁酸聯合LPS對Raw264.7細胞活力影響 根據上述實驗結果，選擇100 ng·mL-1LPS刺激細胞4 h，用于模擬體外感染。同時分別選擇100 μmol·L-1CDCA刺激細胞6 h；100 μmol·L-1CA和200 μmol·L-1DCA分別處理細胞4 h。進一步檢測LPS與膽汁酸聯合處理Raw264.7細胞，對細胞活力的影響。由圖5可知，先用CDCA處理Raw264.7細胞2 h，加入LPS共同培養4 h，模擬膽汁酸淤積的體外模型，與對照組比較，DMSO組細胞活力沒有變化，LPS組細胞活力顯著增加，與DMSO組比較，經100 μmol·L-1CDCA刺激的細胞活力下降；與CDCA組和LPS組比較，CDCA和LPS聯合刺激的細胞活力下降。100 μmol·L-1CA和200 μmol·L-1DCA分別與LPS共同孵育4 h，與對照組比較，DMSO組細胞活力未發生顯著變化，LPS處理后細胞活力顯著上升；與DMSO組比較，CA組細胞活力上升，DCA處理后細胞活力下降；與CA和LPS組比較，CA與LPS聯合處理后增加細胞活力；與DCA組和LPS組比較，DCA與LPS聯合作用顯著下調細胞活力。

①與DMSO組比較，t=3.59，3.77，P<0.05；②與DMSO組比較，t=5.56～11.31，P<0.01；③與CA 50 μmol·L-1組比較，t=6.10～8.21，P<0.01。

①與DMSO組比較，t=5.70～6.52，P<0.05；②與DCA 150 μmol·L-1組比較，t=3.96，3.97，P<0.05；③與DMSO組比較，t=6.28～16.05，P<0.01；④與DCA 150 μmol·L-1組比較，t=7.86，16.44，P<0.01。

2.6細胞的表型變化 為了進一步研究膽汁酸單獨或聯合LPS處理對Raw264.7細胞功能的影響，采用流式細胞術檢測膽汁酸和LPS刺激的巨噬細胞的表型變化，結果見圖6。與對照組比較，單獨用膽汁酸刺激細胞的表型未發生變化，差異無統計學意義(P>0.05)。LPS處理后細胞發生M1型極化。膽汁酸與LPS聯合作用與膽汁酸單獨刺激相比，CDCA和DCA聯合LPS可促進Raw264.7細胞發生M1型極化，CDCA和DCA聯合LPS刺激與LPS或膽汁酸單獨刺激相比可顯著提高M1型極化標志物CD86的水平以及M1/M2比值。CA聯合LPS對巨噬細胞極化影響不明顯。

2.7Raw264.7細胞的吞噬功能 為了進一步研究膽汁酸單獨或聯合LPS處理對Raw264.7細胞吞噬功能的影響，用流式細胞術檢測膽汁酸單獨或聯合LPS處理后Raw264.7細胞對FITC-Dextran的吞噬情況，結果見圖7。與對照組比較，單獨用CDCA和CA刺激細胞對細胞吞噬功能沒有顯著影響，而單獨用DCA刺激的細胞的吞噬能力下降，差異有統計學意義(P<0.05)，LPS處理后細胞吞噬能力增強。與LPS和相應的膽汁酸處理組相比，CDCA和DCA聯合LPS處理顯著下調巨噬細胞的吞噬能力，與CA組比較，CA與LPS聯合作用使細胞吞噬能力增強。

3 討論

免疫系統防御病原體，并維持有機體生命的組織穩態，主要由常駐和招募的巨噬細胞參與。CD163是一種在巨噬細胞上特異性表達的清道夫受體，表達上調是巨噬細胞在炎癥中向其活化表型M2型轉變和清除入侵病原體的標志。巨噬細胞作為專職APC，通過表達CD80/CD86共刺激分子誘導T細胞產生共刺激信號。CD86是M1型巨噬細胞的標志物之一，CD86表達上調提示巨噬細胞發生M1型極化，M1型巨噬細胞促炎細胞因子分泌顯著增多，增加巨噬細胞吞噬功能，清除微生物[7]。膽汁酸代謝與免疫調控之間的關系也被廣泛研究，FXR和G蛋白偶聯受體(TGR5)是膽汁酸重要的受體，FXR和TGR5位于宿主免疫系統中，在固有免疫細胞中表達。膽汁酸作用于巨噬細胞中的FXR和TGR5，參與免疫細胞功能調控，有助于維持機體穩態[2]。

課題組前期研究發現，肝硬化患者體內的膽汁酸代謝譜發生改變，本研究通過體外模擬膽汁淤積對巨噬細胞的影響，選擇LPS共同孵育模擬膽汁酸淤積伴感染的環境，以期闡明疾病狀態下異常代謝的膽汁酸對巨噬細胞功能的影響。以此評價代謝異常膽汁酸在肝硬化伴感染過程中的重要作用。

實驗結果顯示，單獨用LPS刺激Raw264.7細胞時，100 ng·mL-1LPS在刺激細胞4 h時，細胞活力顯著增加，且細胞發生M1型極化，同時細胞的吞噬能力增加。單獨用膽汁酸處理細胞時，100 μmol·L-1CDCA刺激細胞6 h后，可下調細胞的活力，對細胞的吞噬功能和表型沒有影響。100 μmol·L-1CA在處理細胞4 h后可上調細胞活力，對細胞的表型和吞噬功能均無影響。200 μmol·L-1DCA刺激細胞4 h時，細胞活力下降，對細胞的表型無影響，但可下調細胞的吞噬能力。病理濃度的CA處理Raw264.7細胞對細胞因子的分泌沒有影響，而CDCA和DCA可直接激活巨噬細胞的NLRP3炎癥小體，發揮促炎作用[8]。FXR和TGR5受體均為膽汁酸受體，通過與膽汁酸相互作用激活多種細胞內信號通路。不同類型的膽汁酸對巨噬細胞中的FXR和TGR5的親和力不同，其中對FXR受體親和力的順序：CDCA>DCA>CA，對TGR5激活能力順序：DCA>CDCA>CA，膽汁酸激活TGR5和FXR受體后，可抑制免疫細胞功能，如抑制其吞噬和分泌細胞因子的能力。而在感染狀態下，LPS介導巨噬細胞FXR表達下調，膽汁酸無法與FXR結合發揮抑炎作用，從而促進了巨噬細胞活化；另一方面，膽汁酸可通過與TGR5結合，誘導巨噬細胞中ROS生成，促進其向M1型轉化[8-9]。因此不同類型的膽汁酸對巨噬細胞的影響可能依賴于FXR、TGR5的表達平衡。由此推測，膽汁酸對二者影響不同，可能是本實驗中CDCA、 DCA、CA對巨噬細胞活力不同影響的原因。

①與DMSO組比較，t=4.32～14.84，P<0.01；②與對照組比較，t=5.54～9.23，P<0.01；③與膽汁酸組比較，t=4.01～15.42，P<0.01；④與LPS 100 ng·mL-1組比較，t=2.96～37.18，P<0.01。

①與對照組比較，t=2.44，P<0.05；②與對照組比較，t=4.23，10.17，P<0.01；③與膽汁酸組比較，t=3.35～16.12，P<0.01；④與LPS 100 ng·mL-1組比較，t=1.86，P<0.05；⑤與LPS 100 ng·mL-1組比較，t=4.35～7.58，P<0.01。

①與對照組比較，t=2.21，P<0.05；②與對照組比較，t=6.69，P<0.01；③與膽汁酸組比較，t=5.23，2.43，P<0.05；④與膽汁酸組比較，t=3.01，P<0.01⑤與LPS 100 ng·mL-1，t=11.53，11.33，P<0.01。

巨噬細胞具有可塑性，根據局部微環境調整其表型，這使得它在損傷的進展和消退過程中發揮多種甚至相反的功能。在肝硬化狀態下，M1型巨噬細胞分泌促炎細胞因子，進而加重炎癥反應，同時產生活性氧，誘導肝細胞凋亡，加重肝損傷的嚴重程度；M2型巨噬細胞發揮抗炎和組織修復的調節機制，分泌大量促纖維化因子和轉化生長因子，促進肝臟纖維化進程，巨噬細胞的極化狀態對肝硬化的進展具有重要的作用[10]。本研究中CDCA和DCA聯合LPS處理的巨噬細胞向M1型極化，這可能與在LPS的作用下，FXR的表達下調，促進Ca2+內流，激活NLRP3炎癥小體，釋放白細胞介素-1β(IL-1β)有關[8]。

有研究發現，與健康對照組比較，肝硬化患者體內巨噬細胞吞噬能力受損，這與肝病嚴重程度、隨后的感染發展和死亡率呈正相關[11]。吞噬和殺死病原體的能力被認為是巨噬細胞的主要功能。肝硬化時，巨噬細胞上Fc和清道夫受體(如CD163)表達下調，用于識別和清除外來病原體的模式識別受體(PRRs)表達受損，使巨噬細胞無法有效清除凋亡細胞、細胞碎片和免疫復合物等[12-13]。本研究結果顯示，CDCA、DCA與LPS聯合作用下調Raw264.7細胞的吞噬能力，這可能與兩者聯合作用使細胞活力下降有關。此外文獻顯示CDCA和DCA可使巨噬細胞的細胞膜和細胞器發生改變，同時產生的超氧化物減少，從而降低細胞的胞飲作用和清除細菌的能力[14]。

綜上所述，本研究結果顯示，在LPS誘導的體外細胞模型中，3種膽汁酸對細胞活力、極化以及吞噬能力均存在明顯改變，提示在病理狀態下，膽汁酸參與調控巨噬細胞活力、極化以及吞噬功能。實驗表明膽汁酸可能是肝硬化伴感染的潛在治療靶點，在后期的研究中，仍需要進一步通過體內實驗闡明維持膽汁酸穩態對肝硬化并發感染的臨床治療價值。