白細胞介素-33對巨噬細胞羧酸酯酶作用的體外研究*

李敏，徐艷嬌，張程亮，祖越，高前艷，王熙敏，陳云舟

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院藥學部，武漢 430030)

羧酸酯酶(carboxylesterases，CESs)是一類重要的絲氨酸水解酶，也是重要的I相藥物代謝酶，可催化水解內源性和外源性物質，在藥物代謝和脂質代謝中發揮重要作用[1]。研究發現在肝臟、腸道、肺臟等器官中CESs高表達[2]，在腦、胃、腎、脾等組織中有少量表達[3]。CESs的表達和活性與基因多態性、核受體和疾病等多種因素相關[4-5]。如其活性發生變化，將會影響藥物以及外源性毒物的代謝，造成藥物蓄積影響用藥安全性。

炎性細胞因子對于藥物代謝酶的表達和代謝活性的影響多有報道[6-7]。YANG等[8]研究發現，炎性因子白細胞介素(IL)-6可顯著抑制人原代肝細胞以及HepG2細胞中CES1和CES2的表達水平和代謝活性。筆者前期研究發現，免疫性肝損傷中多種炎癥因子的升高伴隨肝臟羧酸酯酶的下降，從而對藥物代謝造成潛在的影響[4]。同時還發現潰瘍性結腸炎中結腸部位IL-6等炎性因子可以經過門靜脈入肝，下調肝細胞的CESs表達和活性[9]。巨噬細胞等免疫細胞也表達CESs，并在藥物代謝、膽固醇及脂肪酸代謝和運輸過程中發揮重要作用[2，10-11]。巨噬細胞作為幾乎遍布機體全身的重要免疫細胞，不僅在免疫方面起著關鍵作用，還可以維持膽固醇的攝取、酯化和外排的動態平衡[12]。巨噬細胞具有異質性和可塑性，其表型和功能受不同環境影響可極化為M1和M2型巨噬細胞。然而，目前有關炎性因子是否可以調控巨噬細胞CESs筆者尚未見報道。因此，本研究選擇前炎癥因子IL-33，通過體外處理RAW264.7細胞，探究其對巨噬細胞極化狀態的影響和CESs的調控作用。

1 材料與方法

1.1材料 RAW264.7巨噬細胞由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院中西醫結合科惠贈；IL-33(PeproTech公司，批號：1106398)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，Gibco公司，批號：16140063)；總膽固醇(TC，批號：A111-1-1)、三酰甘油(TG，批號：A110-1-1)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C，批號：A112-1-1)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C，批號：A113-1-1)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；CCK8細胞試劑盒(MCE公司，批號：68084)；小鼠抗CD206抗體(批號：abs141228)、小鼠抗誘導型一氧化氮合酶(iNOS，批號：abs131793)、小鼠抗β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(批號：abs132184)和小鼠抗受體生長刺激表達基因2蛋白(ST2)抗體(批號：abs132912)購自Absin公司；小鼠抗CES1(Abcam公司，批號：EP1375Y)，CES2抗體(RD公司，批號：AF5280)。

1.2細胞培養 將RAW264.7細胞按合適比例分別接種于6孔板和96孔板中，置于含10% FBS的DMEM培養基中，37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)，95%濕度培養箱中培養。按照實驗設計，給予5，10，20 ng·mL-1的IL-33刺激細胞，干預24 h后，收集細胞，提取細胞蛋白和RNA，用于后續實驗測定。

1.3免疫熒光實驗 將圓形蓋玻片預先置于6孔板底，取對數生長期細胞，按合適的密度接種，并在12 h后給予5，10，20 ng·mL-1的IL-33進行干預，培養24 h后取出蓋玻片，加入4%多聚甲醛固定15 min，Triton-100通透10 min；1%BSA孵育30 min，加入小鼠抗CD206、小鼠抗iNOS抗體，4 ℃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入熒光二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌后加入DAPI染色劑，37 ℃避光孵育2 h，PBS洗去染料，鏡下觀察并攝像。

1.4Western blotting檢測實驗 取對數生長期的細胞以適當密度接種于6孔板中，使用不同濃度IL-33處理細胞。培養24 h后棄上清液，PBS洗滌2次，用Western及IP裂解液提取細胞總蛋白，并測定蛋白濃度。蛋白加入5×上樣緩沖液后，于95 ℃加熱3 min，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠電泳。

1.5反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)的檢測 將細胞以適當密度接種于6孔板中，加入不同濃度IL-33培養24 h后，棄上清液，PBS清洗2次，收集細胞，按照TRIzol說明書提取細胞的總RNA，RT-PCR檢測細胞M1型標志物IL-1β、TNF-α、iNOS和M2型標志物IL-10、TGF-β、Arg1的表達，各引物序列見表1。PCR反應體系如下：2 μL cDNA、10 μL SYBR Green PCR Master Mix、上下游引物各1 μL、6 μL ddH2O。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；(94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s)×30個循環；72 ℃延伸45 s，72 ℃，7 min。

表1 RT-PCR引物序列

1.6CCK-8檢測細胞毒性 將RAW264.7細胞接種于96孔板，給予IL-33干預24 h后，分別加入30 μmol·L-1氯吡格雷和伊立替康，置于培養箱中孵育24 h，棄上清液，每孔加入10% CCK-8液100 μL繼續培養2 h，每組設置復孔3個。30 min后在波長450 nm處測吸光度(A值)，計算細胞存活率，評價細胞CES1和CES2的代謝活性。

1.7油紅O染色鑒定細胞脂質沉積情況 以異丙醇溶解并配置質量分數為5%的油紅O母液，使用時以油紅O母液與去離子水按3∶2混勻即可。制作RAW264.7細胞爬片，以20 ng·mL-1的IL-33干預24 h后，無菌PBS清洗干凈后，4%多聚甲醛固定10 min，無菌PBS清洗干凈，用60%異丙醇浸洗15 s，油紅O染色10 min，體積分數為60%異丙醇分化10 s，去離子水洗凈，蘇木精染色液染色2 min，洗凈甘油封片，于倒置顯微鏡鏡下觀察并攝像。

1.8巨噬細胞TC、TG、HDL-C及LDL-C含量測定 將制備的細胞懸液離心，棄上清液，留細胞沉淀，加入PBS進行勻漿。制備勻漿液，按照相應試劑盒說明書分別測定TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量。

2 結果

2.1IL-33顯著抑制巨噬細胞中CES1蛋白表達水平和代謝活性 不同濃度IL-33干預后，與對照組比較，細胞CES1的蛋白表達水平呈現濃度依賴性下降，差異有統計學意義(P<0.05)；而CES2在巨噬細胞中表達微弱，即使經過IL-33處理，其蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)，見圖1。ST2作為IL-33的特異性受體，在多數免疫細胞中都具有一定的表達。通過檢測巨噬細胞中ST2蛋白表達發現，與空白對照組比較，10及20 ng·mL-1IL-33處理后表達水平顯著升高(P<0.05)，提示IL-33可能通過其受體ST2發揮下調CES1的作用。

CCK-8結果也表明IL-33刺激RAW264.7巨噬細胞后顯著下調CES1和CES2的代謝活性(P<0.05)，見圖2。

2.2IL-33刺激后RAW264.7細胞脂質沉積增多 油紅O染色顯示，IL-33干預后細胞脂質沉積增多，其中20 ng·mL-1的IL-33處理細胞脂滴顯著多于空白對照組，結果見圖3(紅框標記的為巨噬細胞中脂滴數量)。進一步檢測細胞TG、TC、HDL-C和LDL-C發現，IL-33導致巨噬細胞TC、TG及LDL-C增多(P<0.05)，而HDL-C顯著下降(P<0.01)，見圖4。

①與空白對照組比較，t=2.88，P<0.05；②與空白對照組比較，t=-13.15～-3.07，P<0.01。

2.3IL-33誘導巨噬細胞向M2型極化 20 ng·mL-1IL-33干預24 h后，其對M1型標志物的mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)，而M2型標志物Arg1、IL-10和TGF-β表達顯著增多(P<0.05)，見圖5。進一步進行免疫熒光檢測iNOS和CD206(M2型標志物)的蛋白表達，結果發現20 ng·mL-1IL-33刺激后，與空白對照組比較，CD206蛋白表達明顯增多，而iNOS蛋白表達無顯著變化，見圖6。結果表明IL-33干預后誘導RAW264.7細胞向M2型極化。

①與空白對照組比較，t=3.52～3.89，P<0.05。

圖3 IL-33對于巨噬細胞脂質沉積的影響(n=3)

①與空白對照組比較，t=-3.50～-2.36，P<0.05；②與空白對照組比較，t=11.43～12.06，P<0.01。

3 討論

炎性因子IL-33屬于IL-1家族成員，在細胞或組織初受損時可作為警報素釋放[13]。其可通過與免疫細胞表面ST2受體結合誘導免疫細胞釋放炎性因子[14]，在哮喘、類風濕關節炎、免疫性肝損傷等疾病中發揮重要作用[15-16]。本研究通過IL-33干預小鼠RAW264.7巨噬細胞，研究發現IL-33主要促使細胞分化為M2型巨噬細胞，且下調CES1蛋白表達水平以及代謝活性，抑制膽固醇酯的代謝，造成細胞脂質累積。

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，廣泛存在于身體各組織與器官中，參與體內多種生理功能，如維持機體平衡、促進傷口愈合，殺滅外來病原體等。此外，巨噬細胞在維持機體代謝平衡的過程中也起到重要作用。巨噬細胞極化不僅發生在正常生理條件下，還可貫穿疾病的發生、發展以及轉歸的全過程[17-18]。巨噬細胞極化為M1炎性細胞或M2抗炎細胞不僅在炎癥性疾病中發揮重要作用，也參與了許多代謝性疾病、感染、動脈粥樣硬化、膿毒癥以及癌癥等疾病的病理過程[18]。通過免疫熒光以及RT-PCR檢測巨噬細胞極化狀態標志物發現，M2型巨噬細胞標志物CD206、IL-10等的表達顯著升高，而M1型標志物iNOS、IL-1β和TNF-α的表達無顯著變化，表明IL-33刺激使巨噬細胞向M2型極化，這一結果與楊笑瑞等[19]研究結果一致。KUROWSKA-STOLARSKA等[20]研究也發現在氣管炎中，IL-33協同IL-13促使巨噬細胞向M2型極化，誘導Th2型免疫反應，加速疾病進展。

①與空白對照組比較，t=-4.34～-2.89，P<0.05。

CES1和CES2是研究較為廣泛的Ι相代謝酶，CES1在巨噬細胞中有較高的表達。CES1可以調控巨噬細胞中膽固醇的攝取及外排，從而減少細胞中脂質堆積。膽固醇的過量累積不僅是動脈粥樣硬化的一大誘因，還將導致肝臟脂肪性病變，而CESs的存在可有效水解膽固醇，緩解疾病[21-22]。氯吡格雷和伊立替康作為CES1和CES2的特異性底物，經過水解后其代謝產物的細胞毒性分別減少和增加，常被用來評價兩種CESs的代謝活性[23]。體外細胞毒性實驗發現，不同濃度IL-33處理后，氯吡格雷的細胞毒性逐步增加，而伊立替康的細胞毒性依次減少。本研究結果發現給予IL-33顯著抑制CES1的蛋白表達和代謝水平。CES2在巨噬細胞中的表達水平較低，IL-33不影響CES2的蛋白表達水平，卻顯著下調CES2的代謝活性，這一結果提示可能存在其他的蛋白相互作用調控機制。在明確IL-33下調巨噬細胞中CES1的蛋白表達和代謝活性后，通過檢測巨噬細胞脂質沉積情況發現，IL-33處理組脂質沉積及脂滴面積顯著多于空白對照組。CES1可有效催化水解巨噬細胞中膽固醇酯，增強巨噬細胞中膽固醇逆向轉運過程，減少細胞內膽固醇酯的累積。因此，在給予IL-33干預巨噬細胞，觀察到CES1的表達和活性下降后進而檢測細胞中脂質累積情況。經IL-33處理后的巨噬細胞中TC、TG以及LDL-C水平均顯著高于空白對照組，結果表明IL-33下調CES1的表達和代謝活性后抑制了CES1水解膽固醇的功能，造成細胞中膽固醇堆積。巨噬細胞中CES1的表達和代謝活性下降直接影響到脂質穩態，以及藥物和毒物的代謝過程，從而影響動脈粥樣硬化患者和其他患者的用藥安全。

圖6 IL-33對RAW264.7細胞CD206和iNOS蛋白表達的影響(免疫熒光細胞化學染色，n=3)

IL-33作為細胞因子主要與其受體ST2結合發揮作用[24]。本研究結果也發現IL-33處理后巨噬細胞中ST2表達顯著增多，因此推測IL-33可能通過ST2受體作用抑制了巨噬細胞CESs的表達和代謝活性，但是具體的作用通路還有待未來的深入研究來證實。

本研究表明IL-33顯著抑制巨噬細胞中CESs的表達和代謝活性，從而影響細胞中TC、TG等脂質的水解，造成脂質累積，因此可能導致脂質代謝紊亂和藥物代謝障礙。本研究結果可為在IL-33大量釋放的炎癥狀態下，對經CESs代謝的藥物的療效和安全性評估，以及動脈粥樣硬化和肥胖患者機體脂質代謝評價具有參考價值。