利普司他汀粗品的提取工藝優化

劉俊果，陳 敏，張 弘，吳立強

(1.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.華北制藥股份有限公司，河北 石家莊 050015；3.保定九孚生化有限公司，河北 保定 072150)

利普司他汀(Lipstatin)是毒三素鏈霉菌(Streptomycestoxytricini)的次級代謝產物，是一種天然的胰脂肪酶抑制劑，為脂溶性物質，易溶于乙醇、乙酸乙酯、正己烷，幾乎不溶于水，利普司他汀純品為淡黃色油狀液體[1]。利普司他汀因含有不飽和雙鍵，生物活性較高，常溫下不穩定[2]，其四氫衍生物奧利司他(Olistat)已被羅氏公司成功開發為消化吸收阻滯型減肥藥物。奧利司他是一種強效、專一、長效的胃腸道脂肪酶抑制劑[3]，在為肥胖者減輕體重的同時能有效改善由肥胖癥帶來的心血管等疾病的困擾。

從毒三素鏈霉菌發酵液中提取利普司他汀主要采用浸提、萃取、大孔樹脂吸附等工藝。Paul等[4]使用甲醇提取發酵液中的利普司他汀；胡為民等[5]采用丙酮超聲浸提利普司他汀，浸提效率是同體積下甲醇的3倍；何勇巍等[6]采用弱極性或無極性的第一有機溶劑萃取利普司他汀，再用分子篩對萃取液進行選擇性吸附；彭平等[7]采用有機溶劑萃取利普司他汀，將萃取液進行濃縮，再將濃縮液與烷烴、液態有機混合鹽混合，過濾，降溫結晶；閆同順等[8]采用響應面法優化了利普司他汀的提取工藝。傳統工藝提取得到的利普司他汀粗品雜質較多，而且在生產過程中會造成大量的溶劑浪費及廢水產生。鑒于此，作者采用乙醇超聲浸提法從毒三素鏈霉菌發酵液中提取利普司他汀，再經萃取、乙腈冷凍除油處理，得到利普司他汀粗品，并對浸提、萃取工藝進行優化，擬為利普司他汀的純化工序打下基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

毒三素鏈霉菌發酵液，自制。

正庚烷、無水乙醇，分析純，天津永大化學試劑有限公司；乙腈，色譜純，Fisher Chemical；甲酸，色譜純，鵬發化工有限公司；蒸餾水，自制。

島津LC-PDA型高效液相色譜儀，島津企業管理(中國)有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；RE-52AA 型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；DD-5M型低速離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；BSA224S-CW型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；90-3型雙向定時恒溫磁力攪拌器，上海滬西分析儀器廠有限公司；XM7D203型數顯恒溫水浴鍋，上海科析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發酵液的預處理

將毒三素鏈霉菌發酵液于8 000～10 000 r·min-1離心15 min，去上清液，收集菌體，用80 ℃蒸餾水連續清洗2次，于80 ℃恒溫水浴鍋中放置10 min后，8 000～10 000 r·min-1離心15 min，去上清液，收集清洗后的菌絲體。

1.2.2 發酵液的超聲浸提

在菌絲體中加入一定體積分數乙醇，攪拌均勻，置于超聲波細胞粉碎機中破碎一定時間，靜置10 min后，收集含有目標產物的上清液，即得浸提液。

1.2.3 浸提液的萃取

浸提液中加入蒸餾水稀釋至乙醇體積分數為50%～53%，按一定萃取比(浸提液與正庚烷的體積比)加入正庚烷，攪拌20 min，靜置3 h，在一定溫度下連續萃取2次，分出下層萃余相，收集上層正庚烷萃取液，合并2次正庚烷萃取液，進行HPLC檢測。

1.2.4 正庚烷萃取液的濃縮

將正庚烷萃取液置于旋轉蒸發儀中，于-0.07～-0.1 MPa、65～70 ℃下減壓濃縮至干(無冷凝液蒸出)，直至得到黃色油狀正庚烷濃縮液。

1.2.5 乙腈冷凍除油

將正庚烷濃縮液置于60 mL分液漏斗中，加入3倍體積的乙腈，充分混勻，置于冰箱冷凍室，冷卻至-20～-10 ℃，5～8 h后取出，去除下層油相；繼續冷凍5～8 h，再次去除油相，上層乙腈相轉移至量筒中，記錄體積；再轉至小燒瓶中，于-0.07～-0.1 MPa、65～70 ℃下減壓濃縮至干，即得利普司他汀粗品。

1.2.6 色譜條件

C18 Hypersil色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-甲酸水溶液(每190 mL水加甲酸0.1 mL，B)(81∶19，體積比)，流速1.0 mL·min-1，柱溫35 ℃，檢測波長195 nm，進樣量20 μL。

2 結果與討論

2.1 浸提條件的優化

2.1.1 超聲時間對利普司他汀浸提效果的影響(圖1)

由圖1可知，隨著超聲時間的延長，利普司他汀純度及回收率均逐漸升高，當超聲時間為30 min時，利普司他汀純度及回收率均較高；繼續延長超聲時間，利普司他汀純度及回收率變化不大。故選擇超聲時間為30 min。

2.1.2 乙醇體積分數對利普司他汀浸提效果的影響(圖2)

圖2 乙醇體積分數對利普司他汀浸提效果的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分數的增大，利普司他汀純度及回收率均逐漸升高，當乙醇體積分數為80%時，利普司他汀純度及回收率均較高；繼續增大乙醇體積分數，利普司他汀純度降低，回收率變化不大。綜合考慮運行成本等，選擇乙醇體積分數為80%。

2.2 萃取條件的優化

2.2.1 萃取比對利普司他汀萃取效果的影響(圖3)

圖3 萃取比對利普司他汀萃取效果的影響

由圖3可知，隨著萃取比的增大，即浸提液與正庚烷體積比的增大，利普司他汀純度及回收率均逐漸升高，當萃取比為3∶1時，利普司他汀純度及回收率均較高；繼續增大浸提液比例，更多的雜質被萃取，利普司他汀純度降低。故選擇浸提液與正庚烷體積比為3∶1。

2.2.2 萃取溫度對利普司他汀萃取效果的影響(圖4)

圖4 萃取溫度對利普司他汀萃取效果的影響

由圖4可知，萃取溫度對利普司他汀萃取效果的影響顯著，隨著萃取溫度的升高，更多的利普司他汀被萃取出來；但萃取溫度過高，利普司他汀不穩定，易分解。綜合考慮，選擇萃取溫度為80 ℃。

2.3 工藝驗證

正庚烷濃縮液經乙腈冷凍除油后，得到黃色油狀利普司他汀粗品，無味。以200 mL毒三素鏈霉菌發酵液、發酵單位7 g·L-1計算，經預處理、浸提、萃取、除油處理，平均每批發酵液中得利普司他汀粗品0.6 g，回收率為43%，純度約72%。

2.4 利普司他汀粗品的質量分析

為分析利普司他汀粗品質量，將利普司他汀浸提液與利普司他汀粗品的HPLC圖譜進行對比，結果如圖5所示。

圖5 利普司他汀浸提液(a)及利普司他汀粗品(b)的HPLC圖譜

由圖5可知，浸提液的HPLC圖譜中主峰左側有明顯的6個雜質，而經過萃取、除油處理后，雜質明顯減少，峰形更好，且利普司他汀純度提高到72%左右，說明萃取、除油工藝去除了更多的雜質。

3 結論

采用乙醇超聲浸提法從毒三素鏈霉菌發酵液中提取利普司他汀，再經萃取、乙腈冷凍除油處理，得到利普司他汀粗品。確定最佳浸提條件為：超聲時間30 min，乙醇體積分數80%；最佳萃取條件為：以正庚烷為萃取劑，浸提液與正庚烷體積比3∶1，萃取溫度80 ℃。在此條件下，利普司他汀純度及回收率均較高。采用乙腈冷凍除油工藝代替大孔樹脂吸附工藝脫脂，減少了溶劑浪費，降低了生產成本，且操作簡便，更適合工業化生產。