10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑制備及其 對小菜蛾的毒力評價

韋登秀，張成華，黃云霄，胡安龍

(1.貴州大學 農(nóng)學院，貴陽 550025；2.貴州大學 作物保護研究所，貴陽 550025； 3.山東省農(nóng)業(yè)科學院，濟南 250100；4.畢節(jié)市植保植檢站，畢節(jié) 551700)

小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]屬鱗翅目菜蛾科，是一種世界性遷飛害蟲，分布廣泛，已經(jīng)成為全球為害十字花科植物的毀滅性害蟲[1]。據(jù)統(tǒng)計，小菜蛾危害蔬菜所造成的損失一般為30%～50%，嚴重時可達90%以上，甚至絕收[2]。防治小菜蛾的方法有很多種，但化學防治效果較好[3]。然而，對于大多數(shù)農(nóng)藥，特別是殺蟲劑，只有＜0.1%的施藥量到達并作用于靶標[4]。氯蟲苯甲酰胺(chlorantraniliprole)是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中防治小菜蛾的常用藥劑之一。據(jù)調(diào)查[5]，氯蟲苯甲酰胺的大量、不科學使用，導致小菜蛾、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾等害蟲抗藥性日趨嚴重。相關研究表明，2011 年以來，小菜蛾對新型雙酰胺類藥劑氯蟲苯甲酰胺的抗藥性全面爆發(fā)，廣東地區(qū)抗藥性最高可達1 749.96 倍[6]。時隔一年，Wang 等[7]監(jiān)測到42 000 倍抗藥性的抗氯蟲苯甲酰胺小菜蛾田間種群。此外，農(nóng)藥過度施用還會造成對環(huán)境的污染及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等。因此，尋找綠色農(nóng)藥新劑型以降低農(nóng)藥的殘留危害和提升利用率，成為當前農(nóng)藥劑型發(fā)展的熱點方向[8]。近10 年以納米材料為載體的納米農(nóng)藥制劑逐漸成為了人們的研究課題。

通過機械破碎，用納米加工手段將農(nóng)藥活性成分直接加工成納米級粒子；利用納米載體通過吸附、偶聯(lián)和包裹等方式裝載農(nóng)藥，是人們獲得納米農(nóng)藥新劑型的2 種方式[9-10]。關于納米農(nóng)藥制劑的研究與應用，國內(nèi)已有一些報道[11]，但是針對新型殺蟲劑氯蟲苯甲酰胺的納米制劑研究尚未涉及。

基于此，本研究利用普魯蘭酶解法進行脫支處理[12]，切開支鏈淀粉分支點中的α-1,6 糖苷鍵，后用過量的無水乙醇進行沉淀，制成直鏈淀粉納米顆粒并包埋農(nóng)藥，制備出10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑，并采用浸蟲法測定了97%原藥、35%水分散粒劑、10%納米可濕性粉劑對小菜蛾的室內(nèi)毒力，旨在為納米淀粉囊材包裹農(nóng)藥的研發(fā)生產(chǎn)及其在小菜蛾化學防控中的應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：JSM-7200F 型掃描電子顯微鏡(SEM) (北京捷歐路科貿(mào)有限公司)；GZX-9140MBE 型恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；Protect-1FD/117122004 型超凈工作臺(瑞士梅特勒公司)；XS105DU 型分析天平(瑞士梅特勒公司)；SF818 型離心機(張家港市高宏離心機制造有限公司)；VELP AMI4 型磁力攪拌器(常州維度儀器制造有限公司)；HWS 28 型恒溫水浴鍋(上海達平儀器有限公司)；LGJ-10C/E 型冷凍干燥機(四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司)；培養(yǎng)皿(Φ60 mm，上海五一玻璃儀器廠)、養(yǎng)蟲籠等。

藥品和試劑：蠟質(zhì)玉米淀粉(眾誠食化生物科技)；普魯蘭酶液(寧夏夏威實業(yè)集團有限公司)；磷酸緩沖液(諾倫生物有限公司)；99%甲醇(濟南潤豐寶利來工貿(mào)有限公司)；97%氯蟲苯甲酰胺原藥(南京紅太陽股份有限公司)；35%氯蟲苯甲酰胺水分散粒劑(山東鄒平農(nóng)藥有限公司)；10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑(貴州大學農(nóng)安實驗室)。

1.2 供試昆蟲

供試昆蟲為小菜蛾。蟲卵購自河南濟源科云生物有限公司，將買回的小菜蛾蟲卵放入恒溫培養(yǎng)箱進行孵化，將孵化的1 齡幼蟲移至裝有濾紙的培養(yǎng)皿中進行人工飼料飼養(yǎng)。供試人工飼料是購自河南省濟源白云實業(yè)有限公司。

人工飼料飼養(yǎng)法[13]：準備好培養(yǎng)皿、濾紙，將濾紙放入消好毒的培養(yǎng)皿里，把飼料切成正方形小塊后放入培養(yǎng)皿中，最后將剛剛孵化的幼蟲移至培養(yǎng)皿中。1～2 齡時飼料可以適量少些，3～4 齡后飼料需要加量，1～2 齡時2 天更換1 次培養(yǎng)皿，3 齡以上時每天更換1 次。觀察小菜蛾蟲齡達老熟幼蟲后移至干凈的培養(yǎng)皿待其化蛹，完全化蛹后可移至養(yǎng)蟲籠待其羽化。取生長基本一致的2～3 齡幼蟲供生測試驗用。

1.3 試驗方法

1.3.1 納米農(nóng)藥的制備

1.3.1.1 直鏈淀粉納米顆粒的制備

稱取10 g 淀粉于250 mL 燒杯中，加入100 mL磷酸緩沖液(pH=5.0)，攪拌均勻。于100 ℃水浴加熱成糊狀，將糊化好的淀粉冷卻至60 ℃，加入23 mL (1 mL 酶液+66 mL 無菌水)普魯蘭酶液，攪拌均勻，放入60 ℃水浴鍋中水浴6 h，隨后置于電爐上加熱煮沸8 min 使酶失活，將煮沸后的淀粉液加入50 mL的離心管中，3 000 rpm 離心15 min，除去未脫支的分子，取上清液加入燒杯中，后分兩種方式加入無水乙醇：⑴ 無水乙醇體積是淀粉液的3 倍；⑵ 無水乙醇體積是淀粉液的10 倍；然后，放入4 ℃的冰箱里靜置過夜，第2 天取出上清液，留下沉淀，將沉淀冷凍干燥24 h 后取出，放入研缽里研細，再裝入密封袋中并放入4 ℃冰箱冷藏備用[14]。后用掃描電鏡(SEM)對其進行表征，將制備成功的納米顆粒用于制備10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑。

1.3.1.2 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑的制備

稱取制備好的蠟質(zhì)玉米淀粉納米顆粒1 g 于250 mL 錐形瓶中，加入20 mL 去離子水溶解，超聲洗滌器超聲1 h，并放入121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min，取出后置于90 ℃水浴鍋中水浴平衡2 h，使其進一步溶解。稱取97%氯蟲苯甲酰胺原藥0.5 g于燒杯中，加200 mL 酒精溶解完全，隨后將藥液逐滴加入水浴2 h 后的蠟質(zhì)玉米淀粉溶液中，磁力攪拌器攪拌6 h，4 ℃冰箱靜置過夜，取出靜置好的藥液除去上清液，然后分別采用2 種方法進行改造。第1 種是冷凍干燥法，將沉淀預凍過夜，次日將預凍好的材料放置于冷凍干燥機中冷凍干燥24 h，取出充分研磨后裝入密封袋，放入4 ℃冰箱冷藏待用。第2 種是烘干法，直接將靜置好的藥液倒入培養(yǎng)皿中，于70 ℃溫度下烘干6 h，刮下藥粉，充分研磨后裝入密封袋，放入4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑的表征

稱取1 mg 的樣品溶入10 mL 蒸餾水中，超聲5 min 使其分散均勻后，用濾膜過濾后備用；將過濾液滴于帶有碳支持膜的銅網(wǎng)上，用液氮速凍后再將銅網(wǎng)冷凍干燥，將干燥后的樣品放入掃描電子顯微鏡(SEM)系統(tǒng)中，抽真空5 min，在20 kV 加速電壓下觀察，統(tǒng)計并記錄樣品粒徑大小。

1.3.3 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑質(zhì)量指標測定

10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑技術指標：⑴ 水分測定：采用卡爾費休水分測定儀進行測定。⑵ 熱貯穩(wěn)定性測定：參照GB/T19136—2003 農(nóng)藥熱貯穩(wěn)定性測定方法進行，熱貯試驗為2 周，溫度為(54±2) ℃。⑶ pH 測定：酸度用微機型精密pH計法進行測定。⑷ 懸浮率測定：參照GB/T14825—2006《農(nóng)藥懸浮率測定方法》進行測定。⑸ 濕潤性測定：按GB/T5451—2001《農(nóng)藥可濕性粉劑濕潤性測定方法》進行測定。

1.3.4 室內(nèi)毒力測定

室內(nèi)毒力采用浸蟲法測定[15]。根據(jù)參照預試驗結(jié)果，每種農(nóng)藥設置5個濃度梯度：0、1、2、4、8、16 mg/L。每個濃度處理供試蟲源15 頭，設置重復3次，以清水作為對照處理。將生長狀況一致的2～3齡幼蟲放置于干凈的培養(yǎng)皿中，將試蟲放入塑料網(wǎng)罩中，于如上濃度藥液中浸漬5 s 后取出，放在濾紙上爬行，待其自行晾干后，移至鋪有濾紙并置有飼料的潔凈培養(yǎng)皿中，用保鮮膜封口，用牙簽在保鮮膜上扎小孔。最后將培養(yǎng)皿置于溫度(27±1) ℃，濕度為75%～85%，光照為L∶D=14 h∶10 h 的智能人工氣候箱內(nèi)，在24 h 和48 h 后分別觀察和記錄試蟲死亡情況，計算死亡率和校正死亡率。判斷試蟲死亡標準為，用毛筆輕觸蟲體，不動者視為死亡。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)試驗記錄數(shù)據(jù)，以對照死亡率低于5%視為有效測定，算各處理的死亡率和校正死亡率。計算公式如下：

所有試驗數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel 2019 進行處理，將校正死亡率轉(zhuǎn)換為機率值后，采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行分析，求出每種藥劑的毒力回歸方程、LC50及95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 直鏈淀粉納米顆粒表征及直徑

由圖1 可知，在SEM 500 nm、1 μm 2 個視野中觀察到，不同處理下的直鏈淀粉納米顆粒大小不一；由表1 可知，當無水乙醇與淀粉液的體積比為3∶1時，粒徑分布范圍廣，粒徑為10～8 000 nm，平均粒徑為186.70 nm；當無水乙醇與淀粉液的體積比為10∶1時，并延長超聲時間為20 min，粒徑范圍在10～76 nm，平均粒徑為52.23 nm，說明制備納米顆粒以無水乙醇和淀粉液的體積比為10∶1 時為最合適。

圖1 直鏈淀粉納米顆粒掃描電鏡(SEM)圖

表1 直鏈淀粉納米顆粒粒徑測定結(jié)果

2.2 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑表征及直徑

由圖2 可知，在SEM 500 nm、1 μm 2 個視野中觀察到，10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑的外貌形態(tài)不規(guī)則，大多近似球狀。粒徑大小較為均一，粒徑大小為40～85 nm，平均粒徑為64.22 nm。

圖2 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑SEM 圖

2.3 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑的質(zhì)量指標

質(zhì)量指標檢測結(jié)果見表2。可見，制備的制劑外觀為淡黃色，其有效成分含量為10.12%，水分含量為0.92%，粒徑為64.22 nm，pH 為6.8，熱貯穩(wěn)定性為合格狀態(tài)，懸浮率為98.7%，濕潤時間為2.6 min。

表2 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑的質(zhì)量指標檢測

2.4 氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾的毒力

氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾室內(nèi)毒力測定結(jié)果見表3。可見，在設定的5 種濃度下，氯蟲苯甲酰胺97%原藥、35%水分散粒劑、10%納米可濕性粉劑處理后24 h，平均校正死亡率分別是13.64%～81.82%、13.33%～ 77.88%和11.63～83.72%；藥后48 h 時，分別為16.28%～ 97.62%、18.60%～95.35%和19.05%～97.62%，說明10%納米可濕性粉劑藥后24 h 對小菜蛾的平均校正死亡率是最高的；藥后48 h，除16 mg/L 濃度外，35%水分散粒劑對小菜蛾的平均校正死亡率略高于10%納米制劑和97%原藥，但均未達到顯著差異(p＞0.05，p＞0.01)。

表3 氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾的致死率

將表3 中氯蟲苯甲酰胺濃度與小菜蛾死亡機率值之間進行線性回歸，結(jié)果見表4。可見，10%納米可濕性粉劑藥后24 h 對小菜蛾室內(nèi)毒力優(yōu)于97%原藥和市售的35%水分散粒劑。處理后24 h 和48 h 時，3 種氯蟲苯甲酰胺藥劑對小菜蛾的毒性從大到小的順序分別為10%納米可濕性粉劑＞35%水分散粒劑＞97%原藥和35%水分散粒劑＞10%納米可濕性粉劑＞97%原藥。

表4 10%氯蟲苯甲酰胺納米可濕性粉劑對小菜蛾的毒力測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，藥后24 h，氯蟲苯甲酰胺10%納米可濕性粉劑對小菜蛾的活性優(yōu)于97%原藥和35%水分散粒劑。Feng[16]等研究發(fā)現(xiàn)利用納米微膠囊包裹的氯蟲苯甲酰胺納米農(nóng)藥較水分散粒劑具有較強的釋放率，提高了農(nóng)藥的有效利用效率和生物利用度。此外，Gao[17]等制備了一種智能納米載體，用于傳遞氯蟲苯甲酰胺，對小菜蛾的可持續(xù)防治起到一定增強作用。可見，應用納米技術制備微膠囊、載體用于包裹或傳遞農(nóng)藥，均有利于提高殺蟲活性，為害蟲的高效治理提供了一種有前景的策略。